目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

低甲烷排放转基因水稻是实现水稻低碳生产的理想材料.土壤微生物驱动了稻田甲烷的产生,低甲烷排放转基因水稻土壤微生物群落组成的变化不仅影响稻田甲烷排放,也关系到土壤微生态系统的稳定性.通过对细菌16S rRNA基因、真菌ITS基因的高通量测序及mcrA、nifH、amoA和nirS等功能基因的荧光定量PCR,分析了低甲烷排放转基因水稻(86R27-3)与野生型水稻(MH86)土壤微生物群落间的差异.结果显示:稻田土壤细菌群落的α-多样性指数在86R27-3与MH86间无明显差异,且仅在水稻分蘖期86R27-3的土壤真菌群落多样性指数Shannon、Simpson及均匀度指数Pielou_e显著高于MH86(P＜0.05);β-多样性分析表明土壤细菌或真菌群落组成在86R27-3与MH86间均没有显著差异;但在水稻齐穗期:86R27-3 土壤的放线菌门(Actinobacteria)、罗泽真菌门(Rozellomycota)的相对丰度显著高于MH86(P＜0.05),而酸杆菌门(Acidibacteria)、子囊菌门(Ascomycota)的相对丰度显著低于MH86(P＜0.05);土壤微生物群落功能预测显示,86R27-3 土壤氮、硫和锰代谢细菌功能群丰度显著低于MH86(P＜0.05),如分蘖期的土壤硝酸盐还原、硝酸盐呼吸、硫代硫酸盐呼吸及硫呼吸,齐穗期和成熟期的好氧亚硝酸盐氧化及成熟期的锰氧化等;与MH86相比,86R27-3的土壤真菌功能群丰度有减有增,如在水稻不同生育期内的其未定义腐生物银耳目、嗜热囊菌科、镰刀菌属及韦斯特氏菌功能群丰度显著降低(P＜0.05),而其分蘖期的动物内共生体腐生生物毕赤酵母属和未定义腐生物马勃科功能群丰度显著提高(P＜0.05).定量PCR分析表明86R27-3 土壤中的产甲烷细菌mcrA基因丰度显著低于MH86(P＜0.05),同时,土壤固氮菌nifH基因、氨氧化细菌amoA基因及反硝化细菌nirS基因的丰度在86R27-3土壤中也显著降低(P＜0.05).综上所述,低甲烷排放转基因水稻(86R27-3)对土壤细菌或真菌的群落组成没有影响,但可引起主要细菌或真菌种类的相对丰度及某些细菌或真菌功能群丰度发生变化,并显著降低了稻田土壤微生物功能基因丰度.

[目的]通过分子伴侣共表达增强毕赤酵母中异源蛋白酶K的分泌水平,并对其的羊毛无氯剥鳞作用机制进行解析,旨在提高蛋白酶K的表达量并为高效酶法剥鳞技术的应用奠定基础.[方法]利用毕赤酵母表达系统对tprK基因进行异源表达,首次分析了影响蛋白质折叠和质量控制的分子伴侣Ssa1、Erj5、Sil1、Hac1、Kar2、Lhs1 和Ydj1 分别过表达对TPRK的表达量和酶活力的作用,并对TPRK处理的羊毛纤维效果进行分析.[结果]TPRK在毕赤酵母GS115 中表达,其最适反应条件为 65℃、pH 9.0,且具有良好的热稳定性和pH稳定性.过表达ssa1、hac1、erj5 和sil1 基因的重组菌株酶活分别提升了 36.8%、20.0%、17.7%和 14.8%.5 L发酵罐进行高密度发酵,诱导 72 h后,TPRK的酶活达到 77 471.99 U/mL.在羊毛水解应用中TPRK可水解羊毛鳞片内层使鳞片逐渐剥落,起到剥鳞效果,并且最适水解条件为:TPRK添加量为 300 U/mL、反应温度 55℃、pH 9.0 和反应时间 2 h.[结论]过表达分子伴侣Ssa1 能够有效提升TPRK的表达量,利用该TPRK处理羊毛纤维,可有效去除羊毛鳞片层,而对羊毛核心皮质层造成的损伤较小.

目的:观察IGFBP-3抗原在不同真核细胞中的表达差异,筛选最优的IGFBP-3抗原进行IGFBP-3抗原诊断试剂盒开发的校准品性能分析.方法:将人IGFBP-3基因分别克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K及哺乳动物细胞表达载体pCMV中,分别转化毕赤酵母GS115、HEK293细胞及CHO细胞进行表达.以Ni-NTA和SDS-PAGE技术对表达产物进行活性分析及纯化鉴定,利用IGFBP-3检测试剂盒对纯化抗原进行校准品性能分析.结果:IGFBP-3抗原表达过程中易降解,仅在HEK293细胞中成功得到全长蛋白,且配制成的校准品考核反应性及稳定性均满足需求,为诊断试剂盒的进一步开发奠定了坚实基础.结论:HEK293体系表达的IGFBP-3抗原更适用于试剂盒校准品.

[目的]为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492 的生物学功能.[方法]对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492 主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达.利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能.[结果]几丁质酶AO-492 有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18 家族结构域,并含有糖苷水解酶 18 家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构.系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近.SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492 分子量约为 59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应.ReAO-Z492 最适温度为 40℃,最适pH为 7.0;Mg2+对其酶活有促进作用,而Ag+、Cu2+、Fe3+和Zn2+有抑制作用.ReAO-Z492 对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性.[结论]少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用.

结核分枝杆菌(MTB)引起的结核病是一种慢性呼吸道传染病,研制载体介导的ESAT-6疫苗是当前的热点之一,ESAT-6抗原是一种公认的疫苗分子.本研究概述了卡介苗、耻垢分支杆菌、母牛分支杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、格式链球菌、单核细胞增生性李斯特菌、根癌农杆菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、毕赤酵母、流感病毒、高度减毒的牛痘病毒、腺病毒血清型5、慢病毒和昆虫杆状病毒等载体介导的结核分枝杆菌ESAT-6疫苗的研制现状.

利用异源重组表达系统表达外源蛋白是基因工程研究的重点.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲基营养型酵母,由于其易于遗传操作、高水平分泌外源蛋白、翻译后修饰等特点,已成为工业应用中蛋白质生产的重要菌株,常被用于酶制剂的生产.然而,部分外源蛋白在毕赤酵母系统中的表达水平较低,仍有待提升的空间.因此,进一步探索提升毕赤酵母中外源蛋白表达量的原理和方法,将对降低毕赤酵母表达系统工业化生产成本,提高经济效益,具有重要的意义.本文主要从基因水平、转录水平、翻译水平、折叠分泌水平、抗逆水平、发酵工艺六个方面归纳总结了近年来毕赤酵母提高外源蛋白表达的优化策略的研究进展,旨在为提高外源蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达水平提供有益参考.

[目的]在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中建立一套分子靶向突变系统,为毕赤酵母的基因工程改造提供高效的编辑工具.[方法]基于规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9)技术,设计并构建nCas9与胞苷脱氨酶融合表达的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE),并选择酵母基因组中富含碱基C的一段序列作为靶标以评价CBE的碱基编辑功能.电转化酵母后,利用高通量测序技术分析CBE的编辑效率及编辑模式,并进一步探究连接肽长度、融合蛋白相对位置和gRNA靶向序列(即spacer)长度等因素对CBE功能的影响.[结果]nCas9与PmCDA1融合组成的CBE能够实现毕赤酵母基因组碱基C的高效编辑.当连接肽长度为(GGGGS)1o时,CBE的编辑效率最高,编辑窗口位于前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)远端的C20-C14之间,其中C18的编辑效率可达85.1％.nCas9与PmCDA 1相对位置的改变对CBE的编辑效率和编辑模式的影响不大.而gRNA靶向序列长度影响着CBE的编辑效率,且gRNA靶向序列长度不能低于17 nt,但19-23 nt之间均可引导CBE对基因组的高效编辑.[结论]本研究在巴斯德毕赤酵母中构建了 一套具有高效碱基编辑活性的胞嘧啶碱基编辑器,为基于毕赤酵母的基础和应用研究提供了工具支持.

氨肽酶A(aminopeptidase A,Pep A)能特异性地水解N末端为谷氨酸(glutamic acid,Glu)或天冬氨酸(aspartic acid,Asp)的肽链,提高蛋白质的水溶性和食物的风味,在食品工业和肉类加工中具有一定的应用前景.本研究采用全基因合成的方式获得了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis)IL1403 氨肽酶A(Lactococcus lactis-Pep A,Lc-Pep A)的编码基因,将该基因克隆并导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(His4),在毕赤酵母中实现了Lc-Pep A的高效分泌表达,表达产物经鉴定和纯化制备后,进行了生物学特性的分析.结果表明,Lc-Pep A具有较强的底物特异性,对 2 种底物谷氨酸对硝基苯胺(glutamic acid-p-nitroaniline,Glu-pNA)和天冬氨酸对硝基苯胺(aspartic acid-p-nitroaniline,Asp-pNA)具有相似的催化活力和酶动力学参数.Lc-Pep A是一种金属蛋白酶,最适反应温度为 60℃,最适pH为 8.0,具有较宽的热稳定性和酸碱稳定性.金属离子Co2+、Mn2+及Zn2+等对酶活力具有不同程度的激活作用,而Ni2+和Cu2+对酶活力具有强烈的抑制作用.Lc-Pep A 对常规蛋白酶抑制剂不敏感,但能被金属蛋白酶抑制剂、EDTA 及二硫键还原剂抑制.这些研究为Lc-Pep A的生产和指导该酶的应用打下了坚实的基础.

以解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)为代表的非常规酵母凭借较广的底物利用谱、较强的环境耐受性等优势,已成功实现多种天然产物的高效生产.随着合成生物学及基因编辑技术的发展,针对非常规酵母代谢工程改造的工具和策略也逐渐丰富.本文介绍了几类常见的非常规酵母的生理特性、工具开发及应用现状,并总结归纳了天然产物合成优化中常用的代谢工程策略;最后讨论了现阶段非常规酵母作为天然产物合成细胞工厂的优势和不足,并对后续研究和发展趋势进行了展望.