目的:探讨轴突导向因子3A（Sema3A）对脂多糖（LPS）诱导的CD4 +CD25 +调节性T细胞（Tregs）稳定性的作用及机制。 方法:采用体外免疫磁珠法分离和培养C57BL/6J小鼠脾脏CD4 +CD25 + Tregs，将分离的细胞按随机数字表法分为对照组（仅给予抗小鼠CD3e和CD28诱导细胞处于激活状态）、LPS组（在对照组的基础上给予LPS 100 μg/L）、LPS+核转录因子-κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）组（给予LPS 100 μg/L+PDTC 25 mg/L）、LPS+磷酸盐缓冲液（PBS）组（给予LPS 100 μg/L+PBS 10 μL）、LPS+PDTC+重组Sema3A（rSema3A）组（给予LPS 100 μg/L+PDTC 25 mg/L+rSema3A 300 μg/L）和LPS+PBS+rSema3A组（给予LPS 100 μg/L+PBS 10 μL+rSema3A 300 μg/L）。各组培养24 h后，采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫荧光法检测CD4 +CD25 + Tregs特异性标志物叉头翼状转录因子-3（Foxp-3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）和膜相关转化型生长因子-β1（TGF-β1 m+）的基因及蛋白表达，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清液中白细胞介素-10（IL-10）和分泌型转化生长因子-β1（sTGF-β1）的水平，采用免疫荧光法检测细胞凋亡，采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测Foxp-3-Tregs特异性去甲基化区（Foxp-3-TSDR）的去甲基化程度，以反映CD4 +CD25 + Tregs的稳定性，采用电泳迁移率分析（EMSA）检测NF-κB信号通路的DNA结合活性，采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测NF-κB信号通路活性。 结果:与对照组比较，LPS能够增加细胞稳定性，表现为Foxp-3、CTLA-4和TGF-β1 m+的基因及蛋白表达上调，IL-10和sTGF-β1分泌增加，细胞凋亡减少，Foxp-3-TSDR去甲基化程度增加；同时LPS可增加细胞内NF-κB信号通路的DNA结合活性，以及主要分子NF-κB抑制蛋白激酶β（IKKβ）和p65的磷酸化水平，说明LPS增加细胞稳定性的机制与NF-κB信号通路有关。与LPS组比较，PBS并未对细胞稳定性和NF-κB信号通路产生影响；但添加rSema3A后能进一步增加细胞稳定性，并激活NF-κB信号通路。而PDTC能够抑制rSema3A增加细胞稳定性的功能，表现为：与LPS+PBS+rSema3A组比较，LPS+PDTC+rSema3A组Foxp-3、CTLA-4和TGF-β1 m+的基因及蛋白表达明显下调〔Foxp-3基因（2 -ΔΔCt）：8.092±1.117比18.509±1.068，Foxp-3蛋白（相对荧光强度）：1.224±0.033比1.826±0.181；CTLA-4基因（2 -ΔΔCt）：3.254±0.760比11.840±0.827，CTLA-4蛋白（相对荧光强度）：1.305±0.058比1.842±0.111；TGF-β1 m+基因（2 -ΔΔCt）：3.589±1.180比8.509±0.472，TGF-β1 m+蛋白（相对荧光强度）：1.319±0.033比1.822±0.063，均 P<0.01〕，IL-10和sTGF-β1分泌减少〔IL-10（ng/L）：445.33±54.08比992.67±83.10，sTGF-β1（ng/L）：1 116.67±65.25比1 494.67±94.45，均 P<0.01〕，细胞凋亡明显增加（荧光强度：0.398±0.031比0.268±0.046， P<0.01），Foxp-3-TSDR去甲基化程度明显降低（灰度值：0.467±0.048比1.780±0.119， P<0.01），NF-κB信号通路的DNA结合活性被明显抑制（灰度值：1.23±0.02比3.95±0.06， P<0.01），IKKβ和p65的磷酸化水平降低〔p-IKKβ表达（p-IKKβ/IKKβ）：0.97±0.07比1.97±0.04，p-p65（p-p65/p65）：0.95±0.08比1.93±0.06，均 P<0.01〕。 结论:LPS能通过NF-κB信号通路增加CD4 +CD25 + Tregs稳定性；Sema3A能够进一步增加CD4 +CD25 + Tregs稳定性，并且与NF-κB信号通路有关。

目的 基于Delta样配体4(delta-like ligand 4,DLL4)/Notch1信号通路探究人参皂苷Rg-3对氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(azoxymethane/dextran sulphate sodium,AOM/DSS)诱导的炎症相关性结直肠癌小鼠血管形成机制.方法 48只C57BL/6J APCMin/+小鼠随机分为对照组、模型组、人参皂苷Rg-3组(10 mg/kg),每组16只.建立AOM/DSS诱导的结直肠癌模型,采集腹主动脉血与完整结直肠组织,检测血常规与炎症指标,HE染色观察肠组织形态,免疫组化、Western blotting检测肠组织DLL4、Notch 1表达.肿瘤细胞、人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs)分为对照组、人参皂苷Rg-3组、人参皂苷Rg-3+DLL4组,通过MTT、克隆形成、划痕、Transwell与血管形成实验检测细胞增殖、迁移、血管形成能力,Western blotting检测DLL4/Notch信号通路、血管形成相关分子表达情况.结果 与对照组相比,模型组、人参皂苷Rg-3组RBC、Hct、Hb水平降低(P＜0.05),IL-1β、IL-6、TNF-α、DLL4、Notch1表达水平升高(P＜0.05);与模型组相比,人参皂苷Rg-3组RBC、Hct、Hb水平提高(P＜0.05),IL-1β、IL-6、TNF-α、DLL4、Notch1 表达水平下降(P＜0.05),肿瘤数量、2～3.5 mm 及＞3.5 mm 的肿瘤数量减少(P＜0.05).细胞实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷Rg-3组肿瘤细胞、HUVECs增殖、克隆形成、迁移、血管形成能力下降(P＜0.05),DLL4、Notch1、VEGF、VEGFR2、转录因子重组信号结合蛋白 Jκ(recombination signal binding protein-Jκ,RBP-Jκ)、Hes1 表达水平降低(P＜0.05).结论 人参皂苷Rg-3通过抑制DLLA/Notch1信号通路促进血管形成,抑制AOM/DSS诱导结直肠癌进展.

目的 观察Notch1信号通路在慢性肾脏病(CKD)血管钙化大鼠模型主动脉上的表达,探讨该信号通路在CKD主动脉钙化中的作用.方法 将40只SD雄性大鼠随机分为正常对照组(Nor组,n=15)和慢性肾脏病血管钙化组(CKD+VC组,n=25).分别在第4、6、8周后收集两组大鼠尿液检测24 h尿蛋白量;经腹主动脉采血检测肾功能及血钙、血磷.HE染色观察大鼠肾组织病理改变.茜素红染色观察大鼠主动脉钙盐沉积.免疫组化检测大鼠主动脉组织α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Runt相关转录因子2(Runx2)和Notch1、免疫球蛋白κJ区重组信号结合蛋白(RBP-Jκ)、Msh同源异型基因2(Msx2)、Jagged1和Notch1胞内域(N1-ICD)信号蛋白的表达.实时定量PCR检测大鼠主动脉α-SMA、平滑肌肌动蛋白22α(SM22α)、Runx2、碱性磷酸酶(ALP)和Notch1通路相关分子(Notch1、RBP-Jκ、Msx2和Jagged1)的mRNA表达.结果 各时间点CKD+VC组大鼠24 h尿蛋白量、血尿素氮和血肌酐均较Nor组显著升高(均P＜ 0.05).各时间点Nor组大鼠主动脉均未见明显钙盐沉积,CKD+VC组大鼠均可见血管壁中膜层广泛存在呈线性连续分布的钙化斑块.Nor组主动脉壁上α-SMA广泛表达而Runx2仅少量表达;而与Nor组比较,CKD+VC组α-SMA表达显著减少而Runx2显著增加(均P＜ 0.05).Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1和N1-ICD信号蛋白在Nor组大鼠主动脉壁上均仅有微量散在表达;而CKD+VC组大鼠主动脉中上述蛋白在各时间点较Nor组均增加(均P＜0.05).与Nor组相比,CKD+VC组大鼠主动脉中各时间点α-SMA和SM22α mRNA表达均明显降低(均P＜ 0.05),而Runx2和ALP mRNA表达均显著升高(均P＜0.05).各时间点CKD+VC组大鼠主动脉Notch1相关信号通路mRNA表达较Nor组均明显增加(均P＜0.05).结论 CKD血管钙化大鼠主动脉钙化时存在平滑肌细胞的表型转变及Notch 1/RBP-Jκ/Msx2信号通路的激活.该信号通路可能是CKD主动脉钙化重要的信号转导通路之一.

目的 通过体内实验探讨重组信号结合蛋白-Jκ(recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region,RBPJκ)在四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化发生发展中的作用.方法 选取雄性SD大鼠40只为研究对象,以40％CCl4腹腔注射法制备SD大鼠肝纤维化模型.将大鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模型组、腺病毒空载体组(治疗对照组)和RBPJκ干扰腺病毒(AdshRBPJκ)干预组(治疗组),每组各10只.采用苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色和天狼猩红染色观察细胞外基质(extracellular matrix,ECM)含量;采用碱水解法测定大鼠肝组织羟脯氨酸含量;采用qPCR、Western blot和免疫组织化学法检测大鼠肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1、RBPJκ及其靶基因Hey2、HeyL和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)指标[蜗牛家族转录抑制因子1(snail family transcriptional repressor 1,Snail 1)、波形蛋白和E-钙连接素]的表达.结果 ①与正常对照组相比,HE染色、Masson染色和天狼猩红染色示模型组大鼠肝细胞明显肿胀、变性,肝小叶结构被破坏,纤维组织增生明显;模型组大鼠肝内羟脯氨酸含量显著高于正常对照组[(99.35±8.12)μg/mgvs(285.12±12.32)μg/mg,t=38.193,P<0.001)].②RT-PCR、Western blot及免疫组织化学结果显示,模型组大鼠RBPJκ靶基因Hey2、HeyL、胶原相关基因(α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1)以及EMT相关基因Snail 1和波形蛋白转录及翻译水平的表达均显著增加(P均<0.05),但E-钙连接素表达水平降低(P<0.05).③与治疗对照组相比,AdshRBPJκ(治疗组)可改善大鼠肝纤维化程度,降低羟脯氨酸含量[(193.52±13.12)μg/mgvs(279.85±8.32)μg/mg,t=15.92,P<0.001)].④RT-PCR、Western blot及免疫组织化学结果显示,与治疗对照组相比,抑制肝RBPJκ表达(治疗组)不仅可降低RBPJκ及其靶基因Hey2、HeyL的表达水平,也可降低纤维化指标(α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1)及EMT相关基因(Snail 1、波形蛋白)的表达水平,同时还可上调E-钙连接素的表达(P<0.05).结论 高表达的RBPJκ可能参与了肝纤维化的形成过程,抑制RBPJκ可能为肝纤维化的防治提供新方向.

目的 探讨重组信号序列结合蛋白J(RBPJ)-微小核糖核酸155(miR155)-核转录因子-κB(NF-κB)-缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)通路在大鼠脑缺血再灌注损伤中的调控作用及分子机制.方法 60只成年大鼠随机均分为假手术(sham)组(仅分离并暴露颈部血管,不插线栓)和实验组(采用线栓法建立脑缺血-再灌注损伤模型),采用Longa评分评估术后神经功能损伤;0.3 mL/100 g水合氯醛腹腔麻醉大鼠后断头取脑,分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法检测2组大鼠脑组织中RBPJ、miR155、HIF-1α及NF-κB mRNA和蛋白的表达,采用双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀测序miR155与HIF-1α、RBPJ及NF-κB的相互作用位点;采用基因沉默技术干扰RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后,用酶联免疫吸附实验检测2组大鼠脑组织样本中TNF-α、白细胞介素1β(IL-1β)及IL-6相关炎性因子的表达;取新生24 h内SD乳鼠10只,采用75％乙醇浸泡消毒后取脑海马组织消化培养神经元细胞,采用慢病毒转染基因沉默技术在细胞层面验证RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路的相关性.结果 与sham组比较,实验组大鼠出现明显的神经功能损伤(P<0.05),脑梗死面积大于sham组(P<0.05);sham组大鼠脑组织中miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表达水平均低于实验组(P<0.05);沉默RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效应分子中的1种,该通路中其他分子表达均降低(P<0.05);miR155与HIF-1α之间的结合位点为E-box CANNTG,miR155与NF-κB之间的结合位点为AC-CAAAG,双荧光素酶报告提示miR155与NF-κB3′UTR进行结合;抑制RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后,TNF-α、IL-1β及IL-6表达下降(P<0.05).结论 RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路在大鼠脑缺血再灌注损伤中起着重要的负性调控作用,其机制可能与该通路相关因子miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的相互影响和炎症因子的表达有关.

目的 探讨免疫球蛋白κJ区的重组信号结合蛋白(RBP-JK)对CD133阳性室管膜细胞增殖与分化的影响及可能的机制.方法 分离孕12 d的美国癌症研究所(ICR)胚胎小鼠(3只)侧脑室室管膜细胞进行原代培养,并使用 RBP-Jκ-siRNA 干扰 RBP-JK,以及选用2～3月龄体重为20～25 g 的 CD133-CreERTM::ROSA26-LacZ::RBP-Jκflox/flox小鼠(3只),通过腹腔注射他莫昔芬(TAM)敲除RBP-JK,通过免疫荧光双标染色检测CD133阳性室管膜细胞的增殖和分化变化的情况,最后通过Real-time PCR、Western blotting检测RBP-Jκ及其上下游相关分子表达情况.结果 干扰或敲除RBP-Jκ后,无论是细胞还是动物水平CD133或β-半乳糖苷酶(β-GAL)/双肾上腺皮质激素(DCX)/β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)、CD133或β-GAL/微管相关蛋白2(MAP-2)或神经元核抗原(NeuN)、CD133或β-GAL/增殖细胞核抗原(PCNA)双阳性细胞数目均明显增加.同时Real-time PCR和Western blotting结果表明,在干扰或敲除RBP-Jκ后RBP-Jκ-和Splity多毛增强子1(Hes1)mRNA及蛋白表达量均显著下降,而Notch1 mRNA及蛋白的表达量反而显著增加.结论 干扰或敲除RBP-Jκ,通过Notch1表达上调、Hes1表达下调,最终引起CD133阳性室管膜细胞的增殖与分化增加.

目的 探讨丹参素通过调控Notch1/免疫球蛋白κJ区重组信号结合蛋白(RBP-Jκ)/Msh同源异型基因2(Msx2)信号通路对糖尿病肾病大鼠钙磷代谢的影响.方法 2019年10月至2020年4月,北京维通利华实验动物科技有限公司购入SD大鼠,采用高糖高脂饲养4周、腹腔注射链脲佐菌素(STZ,40 mg/kg)建立糖尿病肾病大鼠模型.建模后按随机数字表法分为模型组、丹参素(低、中、高)剂量组(2.5 mL·kg-1·d-1、5.0 mL·kg-1·d-1、10.0 mL·kg-1·d-1)、糖适平组(阳性对照,9.45 mL·kg-1·d-1),每组10只;对照组10只大鼠基础饲料饲养.给予相应的药物连续灌胃4周,1次/天.实验结束,观察大鼠一般情况;血糖仪检测空腹血糖(FBG)水平;24 h尿微量白蛋白(24 h尿mALB)试剂盒检测24 h尿mALB水平;全自动生化分析仪检测血清中钙、磷水平;苏木精-伊红(HE)染色检测大鼠肾脏组织形态;Von Kossa染色检测大鼠肾主动脉钙盐沉积情况;蛋白免疫印迹检测大鼠肾脏组织中Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、Notch1基因的胞内域(N1-ICD)蛋白水平.结果 给药前,与对照组相比,造模组大鼠的FBG、24 h尿mALB水平升高(P<0.05).给药后,模型组大鼠精神萎靡、活动减少,反应迟钝、眼神无力,多饮多食、排尿量增加、垫料易潮湿;出现肾小球肥大、基膜增厚现象,组织纤维化、炎症浸润明显;肾主动脉血管内膜、中膜弹性纤维间出现大量黑色颗粒,血管钙化严重.丹参素(低、中、高)给药组随着剂量的增加,大鼠活动逐渐恢复正常,反应迟钝减少,但仍有多饮多食、排尿量增加、垫料易潮湿现象;肾小球肥大、基膜增厚缓解,组织纤维化消失、炎症缓解;肾主动脉血管内膜、中膜弹性纤维间黑色颗粒减少,血管钙化稍缓解.与对照组相比,模型组FBG、24 h尿mALB水平,血清中钙[(2.89±0.14)mmol/L比(2.24±0.09)mmol/L]、磷[(3.48±0.28)mmol/L比(2.49±0.21)mmol/L]、钙×磷[(126.29±13.16)mg2/dL2比(71.06±13.48)mg2/dL2],肾脏组织中Notch1[(1.06±0.15)比(0.31±0.06)]、RBP-Jκ[(1.15±0.03)比(0.37±0.04)]、Msx2[(0.69±0.05)比(0.23±0.04)]、Jagged1、N1-ICD蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,丹参素低剂量组24 h尿mALB水平,血清中钙、磷、钙×磷,肾脏组织中Notch1,RBP-Jκ、N1-ICD蛋白水平降低,丹参素(中、高)剂量组、糖适平组FBG、24 h尿mALB水平,血清中钙、磷、钙×磷,肾脏组织中Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、N1-ICD蛋白水平降低(P<0.05).结论 丹参素可通过调控Notch1/RBP-Jκ/Msx2信号通路发挥对糖尿病肾病大鼠钙磷沉积现象的改善.

目的 探讨γ分泌酶抑制剂(DAPT)阻断跨膜受体蛋白(Notch)信号通路后,补益营卫方对衰老皮肤表皮干细胞Notch1、Notch配体蛋白(Jagged1)、重组信号结合蛋白(RBP)-Jκ和毛发分裂增强因子(Hes)1表达的影响及其延缓皮肤衰老的机制.方法 消化分离出年轻小鼠和衰老小鼠的表皮,进行表皮干细胞的传代培养.将年轻组细胞分为A组(常规培养基培养)和B组(含5μmol/L DAPT的完全培养基培养);老年组细胞分为C组(常规培养基培养)、D组(含5μmol/L DAPT的完全培养基培养)和E组(含5μmol/L DAPT+2.5％药物血清浓度的完全培养基培养),采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western印迹检测Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1表达水平.结果 与A组比较,B组和C组Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA及蛋白表达水平差异显著(P<0.05);与C组比较,D组和E组Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA及蛋白表达量均明显降低(P<0.05);与D组比较,E组Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05).结论 补益营卫方通过抑制衰老表皮干细胞Notch通路阻断后Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1基因及蛋白的表达,从而起到延缓皮肤衰老的作用.