目的:观察微小RNA(microRNA，miR)-195调控结直肠癌中Notch通路配体Delta样配体4(Dll4)表达，探讨其作用靶点，明确miR-195通过Notch通路抗结直肠癌的分子机制。方法:收集北京大学人民医院胃肠外科2010年11月至2011年2月56例行结直肠癌根治术切除的标本，3、应用芯片技术筛选6例结直肠肿瘤组织和正常肠黏膜组织中micro-RNA的表达差异，用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测miR-195在组织中相对表达量，应用固定化蛋白质印迹法(Western blot)检测56例结直肠癌组织及其邻近正常肠黏膜中Notch通路中Dll4蛋白表达；采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-195与Dll4 3’端非编码区(3’UTR)区的相互作用及活性，采用基因过表达miR-195(40 pmol/L)处理结肠癌细胞系SW480，运用流式细胞仪观察其对细胞凋亡的影响，Western blot检测通路相关蛋白Dll4、锯齿状蛋白1(Jagged1)、Notch受体胞内段(NICD)、细胞周期蛋白(Cyclin) D1、转录因子发状分裂相关增强子1(HES1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、核因子-κB(NF-κB)的表达。组间比较采用方差分析(ANOVA)，独立样本 t检验比较蛋白表达量差异，统计学方法分别采用独立样本 t检验、配对样本 t检验及单因素方差分析。 结果:结直肠癌组织中miR-195表达水平明显低于正常肠黏膜，而Dll4蛋白表达水平高于正常肠黏膜，分别为正常肠黏膜的0.34倍(0.341±0.008)及1.92倍(1.922±0.003) ( t＝3.116、2.374， P<0.05)，差异均有统计学意义，体外转入miR-195后，Dll4荧光素酶活性低于对照组(0.442±0.010、1.010±0.002， t＝4.305， P<0.01)，差异有统计学意义，miR-195和γ-分泌酶抑制剂(DAPT)都可阻断Notch1通路，抑制SW480细胞的增殖(3.1%比17.3%， t＝4.232， P<0.01)，差异有统计学意义，诱导其凋亡(13.7%比48.3%， t＝8.355， P<0.01)，两者具有协同作用( t＝7.474， P<0.01)，差异有统计学意义。同时Notch通路相关蛋白NICD、Hes-1随作用时间延长而表达下降。 结论:结直肠癌中miR-195及Dll4呈拮抗性表达，与其病理学特征密切相关，Dll4为miR-195调控的下游靶基因，miR-195通过负性调控Dll4/Notch信号通路抗结直肠癌。

目的:研究积雪草酸(AA)对糖尿病大鼠血—视网膜屏障(BRB)的保护作用及其可能机制。方法:取健康8周龄雄性SD大鼠96只，按照随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组、低剂量AA组和高剂量AA组，每组24只。取糖尿病模型组、低剂量AA组、高剂量AA组大鼠采用腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，正常对照组注射等量枸橼酸盐缓冲液，模型建立后1个月，低剂量AA组和高剂量AA组分别给予37.5 mg/kg、75.0 mg/kg AA灌胃；正常对照组及糖尿病模型组给予等量0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，每日1次。在给药第0、1、2、3、4周称量大鼠体质量并检测鼠尾静脉血糖值。给药后1个月取大鼠视网膜组织进行实验。采用苏木精—伊红染色法观察大鼠视网膜组织的病理变化；采用伊文思蓝定量法检测BRB的破坏情况；采用免疫荧光染色法检测视网膜组织中Occludin、Notch1、Jagged典型Notch配体1(JAG1)、Delta样典型Notch配体4(DLL4)蛋白的表达分布；采用实时荧光定量PCR法及Western blot法检测Occludin、Notch1、JAG1、DLL4 mRNA及蛋白的表达。结果:给药第4周，高剂量AA组体质量明显高于糖尿病模型组，低剂量AA组和高剂量AA组血糖浓度均低于糖尿病模型组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。正常对照组大鼠视网膜细胞排列整齐，结构层次清晰。糖尿病模型组大鼠视网膜明显增厚，外核层增厚，细胞排列紊乱，结构层次不清晰。低剂量AA组和高剂量AA组大鼠视网膜厚度和结构均较糖尿病模型组明显改善。正常对照组、糖尿病模型组、低剂量AA组和高剂量AA组视网膜中伊文思蓝含量依次为(3.07±1.30)、(13.73±3.88)、(9.57±2.69)和(6.55±1.61)ng/mg，总体差异有统计学意义( F＝18.50， P<0.01)，其中高剂量AA组视网膜中伊文思蓝含量明显低于糖尿病模型组，差异均有统计学意义(均 P<0.01)。糖尿病模型组Occludin蛋白相对表达量明显低于其余3个组，Notch1、JAG1和DLL4蛋白相对表达量明显高于其余3个组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；高剂量AA组Occludin蛋白相对表达量明显高于低剂量AA组，Notch1、JAG1和DLL4蛋白相对表达量明显低于低剂量AA组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与正常对照组比较，糖尿病模型组及低剂量AA组Occludin mRNA相对表达量明显下调，Notch1、JAG1和DLL4 mRNA相对表达量明显上调，差异均有统计学意义(均 P<0.01)；高剂量AA组Occludin mRNA相对表达量明显高于糖尿病模型组和低剂量AA组，Notch1 mRNA相对表达量明显低于糖尿病模型组和低剂量AA组，JAG1和DLL4 mRNA相对表达量明显低于糖尿病模型组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:AA可能通过抑制Notch1信号通路发挥对糖尿病大鼠BRB的保护作用。

目的 基于Delta样配体4(delta-like ligand 4,DLL4)/Notch1信号通路探究人参皂苷Rg-3对氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(azoxymethane/dextran sulphate sodium,AOM/DSS)诱导的炎症相关性结直肠癌小鼠血管形成机制.方法 48只C57BL/6J APCMin/+小鼠随机分为对照组、模型组、人参皂苷Rg-3组(10 mg/kg),每组16只.建立AOM/DSS诱导的结直肠癌模型,采集腹主动脉血与完整结直肠组织,检测血常规与炎症指标,HE染色观察肠组织形态,免疫组化、Western blotting检测肠组织DLL4、Notch 1表达.肿瘤细胞、人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs)分为对照组、人参皂苷Rg-3组、人参皂苷Rg-3+DLL4组,通过MTT、克隆形成、划痕、Transwell与血管形成实验检测细胞增殖、迁移、血管形成能力,Western blotting检测DLL4/Notch信号通路、血管形成相关分子表达情况.结果 与对照组相比,模型组、人参皂苷Rg-3组RBC、Hct、Hb水平降低(P＜0.05),IL-1β、IL-6、TNF-α、DLL4、Notch1表达水平升高(P＜0.05);与模型组相比,人参皂苷Rg-3组RBC、Hct、Hb水平提高(P＜0.05),IL-1β、IL-6、TNF-α、DLL4、Notch1 表达水平下降(P＜0.05),肿瘤数量、2～3.5 mm 及＞3.5 mm 的肿瘤数量减少(P＜0.05).细胞实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷Rg-3组肿瘤细胞、HUVECs增殖、克隆形成、迁移、血管形成能力下降(P＜0.05),DLL4、Notch1、VEGF、VEGFR2、转录因子重组信号结合蛋白 Jκ(recombination signal binding protein-Jκ,RBP-Jκ)、Hes1 表达水平降低(P＜0.05).结论 人参皂苷Rg-3通过抑制DLLA/Notch1信号通路促进血管形成,抑制AOM/DSS诱导结直肠癌进展.

目的 基于Notch信号通路探究牡荆素对哮喘模型小鼠的改善作用及机制.方法 采用卵清蛋白与氢氧化铝混悬液腹腔注射和卵清蛋白雾化激发的方法构建哮喘小鼠模型.将哮喘小鼠随机分为模型组、牡荆素组(40 mg/kg)、Notch激活剂组(1 mg/kg Jagged1)、牡荆素+Notch激活剂组(40 mg/kg牡荆素+1 mg/kg Jagged1),每组12只;另取12只小鼠设为对照组.各组小鼠灌胃/腹腔注射相应药物或生理盐水,每天1次,连续14 d.末次给药后,检测小鼠静息每分钟通气量(VE)、呼气峰流速(PEF),观察肺组织病理形态并检测纤维化变性情况,测定外周血中辅助性T细胞17(Th17)、调节性T细胞(Treg)比例并计算Th17/Treg值,测定血清中白细胞介素18(IL-18)、IL-6、IL-17、IL-10水平,检测肺组织中Notch1、Delta样配体4(DLL4)、发状分裂相关增强子1(Hes1)蛋白表达.结果 与对照组比较,模型组小鼠肺组织发生严重病理损伤及炎症细胞浸润;VE、PEF、外周血中Treg细胞比例、血清中IL-10水平均显著降低(P＜0.05);肺组织中胶原容积分数(CVF),外周血中Th17细胞比例、Th17/Treg值,血清中IL-18、IL-6、IL-17水平,肺组织中Notch1、DLL4、Hes1蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05).与模型组比较,牡荆素组小鼠肺组织病理损伤明显改善,上述指标变化趋势被显著逆转(P＜0.05),且Notch激活剂Jagged1可显著逆转牡荆素对哮喘小鼠的上述药理功效(P＜0.05).结论 牡荆素可通过抑制Notch信号通路,改善哮喘小鼠肺功能、Th17/Treg免疫失衡及炎症反应,减轻肺组织病理损伤及纤维化.

目的 通过观察桃红四物汤对创伤性股骨头坏死大鼠血管内皮细胞生长因子受体 2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、Delta样配体 4(Delta-like 4,Dll4)蛋白表达的影响,探究其防治创伤性股骨头坏死的作用机制.方法 将 44只大鼠采用随机数字表法分为正常组(10只)和造模组(34只).造模组行创伤性股骨头坏死造模;8 周后从正常组和造模组分别随机取 2只进行对比检测造模是否成功.将造模成功的剩余 32只大鼠按随机数字表法分为模型组及桃红四物汤低、中、高剂量组,每组8只;加上正常组剩余大鼠8只,共计5组.正常组和模型组予以生理盐水灌胃;桃红四物汤低、中、高剂量组分别予以 9、18、36 g/kg桃红四物汤灌胃.持续 4周后采集股骨头标本,采用micro-CT观察股骨头组织形态学,光镜下检测空骨陷窝率,免疫组织化学法测定VEGFR2和Dll4的蛋白表达水平.结果 与正常组对比,其余 4组大鼠股骨头均有不同程度的骨质破坏、软骨面塌陷及空骨陷窝率升高(P＜0.05);模型组和桃红四物汤低剂量组VEGFR2 蛋白表达均下降(P＜0.05);桃红四物汤中、高剂量组Dll4 蛋白表达明显增加(P＜0.05).与模型组对比,桃红四物汤中、高剂量组大鼠股骨头软骨形态改善,组织空骨陷窝率下降(P＜0.05);桃红四物汤低、中、高剂量组VEGFR2蛋白表达均升高(P＜0.05);桃红四物汤中、高剂量组Dll4 蛋白表达升高(P＜0.05).结论 桃红四物汤能有效降低创伤性股骨头坏死骨组织空骨陷窝、改善组织形态,可能与增加VEGFR2、Dll4蛋白的表达、激活VEGF/Notch信号通路有关.

目的:探索缺血缺氧(H/I)条件下丁苯酞(NBP)通过激活血管内皮生长因子( VEGF)/VEGF受体2(VEGFR2)-Notch1/Delta样配体4(Dll4)信号促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管形成的机制.方法:利用无血清培养基和缺氧罐模拟H/I条件,HUVECs传代培养后设置正常对照( control)组、H/I组、NBP高剂量( H/I+NBPhigh)组和NBP低剂量(H/I+NBPlow)组,其中 control组为常规培养的 HUVECs,H/I组为 H/I条件下培养的HUVECs,H/I+NBPhigh组为在H/I环境下使用20 μmol/L丁苯酞干预的HUVECs,H/I+NBPlow组为在H/I环境下使用5 μmol/L丁苯酞干预的HUVECs. CCK-8法检测各组细胞的细胞活力,细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力,体外血管形成实验检测各组细胞成管能力,Western blot法检测VEGFR2、Notch1和Dll4的表达,ELISA法检测培养基中VEGF的表达,qPCR检测VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表达水平.结果:丁苯酞可以提高H/I条件下HUVECs的存活率,促进细胞的迁移和体外血管的形成能力,且H/I+NBPhigh组比H/I+NBPlow组更加显著.丁苯酞可以提高VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA及蛋白表达.结论:丁苯酞可以在H/I条件下促进HU-VECs形成血管,其机制可能与VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信号的激活有关.

目的:探讨脉络宁局部灌注对挤压伤综合征模型猪Wnt/β-连接蛋白(β-catenin)和Notch通路的影响.方法:24只巴马小型猪随机分为正常对照组、模型组、常规灌注组和脉络宁灌注组,每组6只.除正常对照组外,其余各组建立挤压伤模型,建模结束后模型组即刻恢复血供,常规灌注组和脉络宁灌注组建模前处理,建模后分别给予常规灌注和脉络宁灌注1 h后恢复自身血供.各组恢复自身血供4 h后,采用苏木素-伊红(HE)染色检测骨骼肌组织形态;透射电镜观察骨骼肌超微结构;ELISA法检测血清中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;RT-qPCR检测骨骼肌组织中血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)mRNA水平;Western blot检测骨骼肌组织中β-catenin、Delta样配体4(Dll4)和Notch的蛋白水平.结果:HE结果显示模型组骨骼肌肌纤维排列紊乱,肌核肿胀或固缩明显,肌膜皱缩,血管破裂、肿胀,肌间质水肿,炎症细胞浸润明显;电镜结果显示模型组肌丝排列紊乱、出现溶解,肌纤维I带、A线和Z线部分丧失,内质网、线粒体和肌核肿胀明显,出现大量的核聚集和核内移.常规灌注组略轻于模型组.脉络宁灌注组HE显示骨骼肌形态基本正常,肌纤维较常规灌溉组排列整齐,肌膜皱缩或肿胀现象不明显,血管基本恢复正常;电镜结果显示肌纤维I带、A线和Z线清晰可见且规则,细胞核排列整齐.与正常对照组相比,模型组组织肿胀、血管破损比例和Z线异常百分率,血清中IL-1β和TNF-α水平,骨骼肌组织中VEGF和MMP-2的mRNA水平,β-catenin核蛋白/β-catenin总蛋白、Dll4和Notch蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,常规灌注组组织肿胀、血管破损比例和Z线异常百分率,血清中IL-1β和TNF-α水平,骨骼肌组织中MMP-2的mRNA水平,核β-catenin/β-catenin总蛋白、Dll4、Notch的蛋白水平及脉络宁灌注组血清中的IL-1β和TNF-α水平,骨骼肌组织中VEGF和MMP-2的mRNA水平,β-catenin核蛋白/β-catenin总蛋白、Dll4、Notch的蛋白水平均降低(P<0.05);与常规灌注组相比,脉络宁灌注组组织肿胀、血管破损比例和Z线异常百分率,血清中的TNF-α水平,骨骼肌组织中VEGF和MMP-2的mRNA水平,核β-catenin/β-catenin总蛋白、Dll4、Notch蛋白水平降低(P<0.05).结论:脉络宁局部灌注可抑制Wnt/β-catenin和Notch通路,缓解炎症和血管损伤,从而实现对挤压伤综合征的保护.

目的 探讨扶肾方对尿毒症腹膜透析大鼠的腹膜超滤功能及腹膜组织Notch1、delta-样配体4(Dll4)、Notch胞内域(NICD)、Hes1、血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的影响.方法 采用随机数字表法将50只雄性SD大鼠分为正常组、模型组、扶肾方低剂量组(模型+扶肾方324 g/L灌胃)、扶肾方高剂量组(模型+扶肾方648 g/L灌胃)和塞来昔布组(模型+塞来昔布1.8 g/L灌胃),每组10只.规律腹腔注射腹膜透析液4周,行腹膜平衡实验计算超滤量后处死大鼠,取腹膜组织,HE染色观察腹膜形态学变化,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白印迹法检测Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGF、VEGFR-2的mRNA和蛋白表达,蛋白印迹法检测p-VEGFR-2的蛋白水平.结果 模型组、扶肾方低剂量组、扶肾方高剂量组及塞来昔布组大鼠腹膜超滤量明显低于正常组,扶肾方高剂量组与塞来昔布组超滤量高于模型组和扶肾方低剂量组,塞来昔布组超滤量低于扶肾方高剂量组(P<0.05).腹膜HE染色显示,扶肾方低剂量组与高剂量组大鼠腹膜新生血管较模型组明显减少.与正常组比较,模型组大鼠腹膜组织Notch1、Dll4、NICD、Hes1 mRNA及蛋白表达均下调,VEGFR-2、VEGF mRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表达上调(P<0.05).与模型组比较,扶肾方低剂量组NICD、Hes1 mRNA及Notch1、Dll4、NICD、Hes1蛋白表达上调,VEGFR-2、VEGF mRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表达下调(P<0.05);扶肾方高剂量组Notch1、Dll4、NICD、Hes1 mRNA及Dll4、Hes1蛋白表达上调,VEGFR-2、VEGF mRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表达下调(P<0.05);塞来昔布组Notch1 mRNA及Notch1、Dll4蛋白表达上调,VEGFR-2、VEGF mRNA及p-VEGFR-2、VEGFR-2、VEGF蛋白表达下调(P<0.05).结论 扶肾方可改善腹膜超滤功能,该作用可能与上调腹膜组织Notch1、Dll4、NICD、Hes1 mRNA及蛋白表达,下调VEGFR-2、VEGF mRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表达有关.

目的 探讨低分子肝素对子痫前期(preeclampsia,PE)患者胎盘组织中血管内皮细胞的Notch信号通路配体Delta样配体4(Delta-like ligand 4,DLL4)表达的影响,及其对内皮细胞损伤的作用及相关机制.方法 选取2018年3月至2019年4月在海南医学院第二附属医院妇产科住院分娩的早发型重度PE患者60例,按随机数字表法将其分为PE组(单用硫酸镁)与低分子肝素组(联合使用硫酸镁与低分子肝素),各30例.选取同期正常妊娠剖宫产妇女30例为对照组.免疫组织化学法观察对比3组产妇胎盘组织中DLL4的表达水平;ELISA检测3组孕产妇外周血中内皮损伤相关细胞因子内皮素-1(endothelian-1,ET-1)、可溶性血管细胞黏附分子-1(soluble vascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1)的表达;体外培养脐静脉内皮细胞,预先应用低分子肝素进行干预,再应用PE患者血清进行刺激,TUNEL染色,内皮细胞通透性检测观察低分子肝素对PE血清诱导的内皮细胞凋亡,内皮细胞完整性的影响;Western blot检测低分子肝素对PE血清诱导的内皮细胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3表达的影响,并使用Notch信号通路阻滞剂MK-0752进行干预,观察低分子肝素是否通过Notch/DLL4信号通路抑制PE血清诱导的内皮细胞凋亡.结果 DLL4主要表达于胎盘组织的血管内皮细胞中,且与对照组(63.5％)相比,PE组及低分子肝素组的胎盘组织中DLL4的表达阳性率(分别为14.7％、36.9％)均明显更低,而低分子肝素组较PE组中DLL4的表达明显更高,差异均有统计学意义(P＜0.05);与对照组相比,PE组及低分子肝素组产妇血清中ET-1、sVCAM-1表达水平明显更高;与PE组相比,低分子肝素组产妇血清中上述细胞因子的表达水平明显更低,差异均有统计学意义(P＜0.05).预先使用低分子肝素处理可显著抑制PE血清诱导的内皮细胞凋亡,并改善PE血清对其的通透性影响,从而保护内皮细胞的完整性.Western blot结果表明,低分子肝素能够通过促进抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,抑制促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3的表达来改善PE血清对内皮细胞损伤,而使用Notch信号通路抑制剂MK-0752能显著逆转低分子肝素对凋亡相关蛋白的上述影响.结论 联合使用低分子肝素能够通过促进胎盘组织内皮细胞中DLL4的表达,其可能通过Notch/DLL4信号通路抑制内皮细胞的凋亡,从而保护内皮细胞的完整性,改善PE的临床预后.