目的:了解1株人流感H3N2毒株的全基因组序列特征、遗传进化及生物学特性。方法:对浙江省丽水市分离的1株H3N2流感毒株进行全基因组测序，从美国国立生物信息中心(NCBI)和全球倡议分享流感数据库(GISAD)获取其他流感毒株基因组全序列，通过BioEdit7.0.9将该毒株8节段基因与其他序列比对，MEGA7.0软件邻接法构建进化树，并全面分析该毒株的进化、致病力和抗原性等特征。结果:测序得到该毒株为人流感分离株A/Homo sapien/China/LS340/2019（H3N2）株（LS340），LS340为典型的季节性人流感病毒，血凝素基因属于3C.2a1进化分支，具备人际传播能力，部分位点呈现高传播性和高致病性特征，对金刚烷胺耐药。与当季推荐疫苗株相比，抗原区出现涉及A、B两个表位3个位点突变。结论:LS340未出现重组、缺失等较大变异，但与当季推荐疫苗株相比已经发生抗原漂变，应及时更新疫苗，同时加强此类病毒变异监测，防止流感大流行发生。

目的:对从云南重症手足口病患者的粪便样品中分离出的1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4，CV-A4)毒株的全基因组特征和部分区段重组情况进行分析，为深入认识CV-A4的流行和分子进化提供基础数据。方法:分别使用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma，RD)细胞、人胚肺二倍体(human embryonic lung diploid，KMB17)细胞和人非小细胞肺癌(human lung cancer，A549)细胞进行病毒分离。提取病毒RNA，通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)分段扩增CV-A4全长基因，利用MEGA7.0和SimPlot 3.5.1等软件对全基因组及各区段进行分析。结果:从RD细胞上分离到一株CV-A4分离株R11-20/YN/CHN/2011，系统进化分析显示该分离株属于C2基因亚型。在VP1和全基因组核苷酸序列上与其同源性最高的分别是CV-A4毒株09214/SD/CHN/2009和CVA4/SZ/CHN/09。重组分析显示该分离株与肠道病毒A71(enterovirus A71，EV-A71)云南分离株R993/YN/CHN/2010在3D区发生过重组。结论:CV-A4分离株R11-20/YN/CHN/2011为C2基因亚型且与EV-A71在3D区发生重组。

目的:调查云南省4个艾滋病主要流行地区人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)毒株 gag基因序列的变异特征。 方法:利用完全随机抽样法抽取2019年1月至2020年12月云南省昆明市、德宏傣族景颇族自治州、红河哈尼族彝族自治州和临沧市抗病毒治疗定点机构进行随访治疗的480例人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染/艾滋病患者，收集其流行病学信息，采集血浆标本后送至云南省传染病医院进行分析，采用巢式聚合酶链反应扩增HIV-1 gag基因，并进行基因分型，采用MEGA 6.06软件构建系统进化树，采用VESPA在线分析工具分析特征性氨基酸，采用Distance程序计算 gag，以及gag蛋白不同区段的基质蛋白p17、衣壳蛋白p24、核衣壳蛋白p7及p6蛋白的基因距离。采用SNAP程序分析同义突变频率与非同义突变频率比值(Ks/Ka值)。多组间统计学比较采用方差分析。 结果:404例患者成功获得 gag基因序列，其中以男性居多(250例，61.9%)，年龄为40~59岁者占59.7%(241/404)，传播途径主要为异性性传播(61.4%, 248/404)。主要流行的HIV-1亚型依次为流行重组型(circulating recombinant form, CRF)08_BC 155例(38.4%)，CRF01_AE 74例(18.3%)，独特重组型(unique rebombinant form，URF)52例(12.9%)、CRF07_BC 39例(9.7%)，C亚型34例(8.4%)，其他亚型28例(6.9%)，B亚型22例(5.4%)。构建系统进化树发现，CRF08_BC亚型形成了2个主要传播簇，2个传播簇间共有8个位点的特征性氨基酸分布存在显著差异，分别为第79、93、121、122、151、363、395和396位点。CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC的 gag基因距离分别为0.090±0.004、0.088±0.004和0.078±0.002，差异有统计学意义( F＝118.33， P<0.001)。3种主要亚型中， gag区段的Ks/Ka值分别为4.003±1.309、4.141±0.860和4.514±1.215，差异有统计学意义( F＝1.35， P<0.001)；p17区段的Ks/Ka值分别为2.590±0.186、2.831±0.496和2.936±0.475，差异有统计学意义( F＝1.59， P<0.001)；p24区段的Ks/Ka值分别为12.579±1.116、10.185±0.494和8.522±0.595，差异有统计学意义( F＝1.61， P<0.001)；p7区段的Ks/Ka值分别为10.850±0.711、9.717±0.932和8.522±0.026，差异有统计学意义( F＝4.24， P<0.001)；p6区段的Ks/Ka值分别为3.122±0.134、3.040±1.498和4.841±0.353，差异有统计学意义( F＝10.68， P<0.001)。 结论:云南省4个地区中主要流行的亚型为CRF08_BC亚型，CRF08_BC的不同传播簇形成了不同的氨基酸组成模式，不同亚型 gag基因不同区段的变异程度不同，应加强对HIV变异毒株的监测，控制其流行蔓延。

目的:了解安徽省柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4，CV-A4)毒株全基因组序列变异及分子进化情况，为今后手足口病的病原学监测和科学防治提供理论依据。方法:采用一代测序法对2020年5株CV-A4分离株进行全基因组测序。运用MEGA11.0对5株CV-A4分离株，32株CV-A4代表株和肠道病毒A71型(Enterovirus A71，EV-A71)原型株BrCr基于VP1区构建系统进化树，对分离株以及肠道病毒A组(enterovirus A，EV-A)原型代表株基于P1、P2、P3区分别构建系统进化树；选用DNAStar进行毒株VP1区氨基酸序列比对，使用BioEdit7.2进行氨基酸置换熵分析并作氨基酸位点熵值图，使用SimPlot3.5和RDP4对CV-A4分离株和EV-A原型代表株进行重组分析，使用DnaSP6软件进行分离株和参考代表株的选择压力分析。结果:系统进化树显示：分离株属于C2亚型，与中国大陆地区流行的CV-A4毒株属于同一分支，C2亚型分支的毒株氨基酸序列同源性为97.30%～100%，分离株同原型相比，均有6个氨基酸变异位点。选择压力分析表明C2亚型的CV-A4毒株受负选择压力的影响，置换熵分析编码区氨基酸序列有25个易突变位点，占比1.14%，毒株进化主要依赖重组。重组分析表明分离株在P2、P3区域与多种EV-A原型株发生不同区段的重组，与CV-A5原型株重组区段较长，尤其在3A-3C区段，P1是相对保守的区段。结论:安徽省CV-A4在P2、P3区与其他EV-A原型株发生频繁重组事件，应对安徽省CV-A4的分子进化研究继续保持密切关注。

目的:了解浙江省衢州地区儿童病毒性脑炎埃可病毒(Echovirus, ECHOV)优势血清型与变迁并分析ECHOV VP1基因分子特征。方法:采集53例病毒性脑炎患儿脑脊液标本进行病毒分离培养。采用荧光RT-PCR和PCR分别检测脑脊液标本中人肠道病毒(human enterovirus，HEV)包括ECHOV、柯萨奇病毒(coxsackie virus，CV)和新型肠道病毒(enterovirus，EV)，以及流行性乙型脑炎病毒(japanese encephalitis virus, JEV)、腮腺炎病毒(mumps virus, MuV)、西尼罗病毒(west nile virus，WNV)、基孔肯雅病毒(chikungunya virus，CHIKV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)和巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)。HEV阳性脑脊液标本采用RT-PCR法扩增HEV-B组全长VP1基因序列，测序后用多种生物信息学软件分析ECHOV VP1基因型、基因重组和遗传进化特征。结果:RD细胞分离培养出6株毒株，但Hep-2细胞分离培养结果均阴性。11份标本HEV通用荧光RT-PCR结果阳性，但其他病毒检测结果均阴性。11份HEV阳性标本中6份检出ECHOV，与分离培养结果一致，分别为4株ECHO6、1株为ECHO7和1株ECHO30血清型，柯萨奇病毒和EV检测结果均阴性。4株ECHO6病毒属于ECHO6-C2基因亚型，但分为ECHO6-41/46和ECHO6-45/48两个流行克隆，ECHO7和ECHO30分别属于ECHO7-C和ECHO30-C基因型。ECHO6与ECHO30病毒在进化过程中存在VP1基因重组。结论:ECHOV是该地区儿童病毒性脑炎主要病原体，且可能存在局部暴发流行。ECHO6与ECHO30病毒VP1基因存在重组可能性，ECHO6有成为ECHOV优势血清型的可能。

目的:了解2016年至2019年云南省德宏傣族景颇族自治州(以下简称"德宏州")境内新报告缅甸籍人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)/丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)合并感染者的HIV和HCV基因亚型分布特征。方法:通过全国艾滋病综合防治数据信息系统收集2016年1月至2019年12月德宏州境内新报告缅甸籍HIV/HCV合并感染者共1 289例，选取血浆样本留存量≥200 μL的996例患者进行HIV和HCV基因亚型检测。采用巢式聚合酶链反应分别扩增HIV pol基因区、HCV核心蛋白结合包膜蛋白(core protein-binding envelope protein， CE1)基因区和非结构蛋白5B(non-structural protein 5B， NS5 B)基因区，通过MEGA 7.0软件构建系统进化树，明确基因分型。统计学分析采用 χ2检验，采用趋势 χ2检验分析HIV和HCV基因亚型逐年变化趋势。 结果:996例HIV/HCV合并感染者中，554例(55.6%)成功扩增HIV和HCV基因片段并明确分型。HIV和HCV基因分型呈多样化。HIV基因亚型以C型和BC重组亚型为主，分别占40.3%(223/554)和33.6%(186/554)；其次为B型、流行重组型(circulating recombinant form，CRF)01_AE型，分别占6.5%(36/554)和3.6%(20/554)。HCV基因亚型以3b型为主，占31.2%(173/554)；其次为6u、1a、6n、3a、6xg型，分别占19.5%(108/554)、17.5%(97/554)、11.4%(63/554)、8.7%(48/554)、6.3%(35/554)。2016年至2019年HIV C型的构成比呈逐年下降趋势( χ趋势2＝7.23， P<0.001)，BC重组亚型呈上升趋势( χ趋势2＝5.97， P<0.001)。2019年BC重组亚型构成比为54.9%(101/184)，高于C型的21.7%(40/184)。2016年至2019年HCV 3b型、6u型、1a型的构成比无明显变化趋势( χ趋势2＝1.43、1.79、0.39， P＝0.152、0.074、0.695)。不同民族患者的HIV基因亚型分布差异有统计学意义( χ2＝22.06， P＝0.037)。 结论:德宏州境内缅甸籍HIV/HCV合并感染者的HIV和HCV基因亚型种类复杂多样。其中，HIV BC重组亚型成为优势传播毒株的趋势显著，需要进一步加强对境内缅甸籍人群中HCV和HIV基因亚型流行特征的监测。

目的:通过构建浙江省北部区域(嘉兴市和湖州市)人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)流行株的分子传播网络，探索HIV-1在该区域的传播特征。方法:以2017年嘉兴市和湖州市新诊断的371例人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者为研究对象，采集其血样并收集其基本人口学及流行病学信息。从血浆中提取RNA，运用反转录聚合酶链反应和巢式聚合酶链反应扩增HIV-1 pol区基因序列，构建进化树判定亚型。计算两两序列间的基因距离，筛选最佳基因遗传距离阈值，构建分子传播网络。统计学方法采用 χ2检验。 结果:成功获得336份样本的 pol区基因序列，共检出11种亚型，以流行重组型(circulating recombinant form，CRF)07_BC亚型[40.8%(137/336)]和CRF01_AE亚型[31.2%(105/336)]为主。以1.0%的基因遗传距离阈值绘制HIV-1分子传播网络，119例患者共形成38个分子簇(簇内患者数为2～28例)，以男性为主[82.4%(98/119)] ，以年龄≥40岁者居多[52.9%(63/119)]，主要感染CRF07_BC亚型[57.1%(68/119)]和CRF01_AE亚型[24.4%(29/119)]，其中CRF07_BC入网率[49.6%(68/137)]高于CRF01_AE入网率[27.6%(29/105)]，差异有统计学意义( χ2＝5.27， P＝0.022)；存在2个较大分子簇C1(含28例患者)和C2(含11例患者)，C1中男男同性传播占60.7%(17/28)，C2中男男同性传播有7例。高传播风险病例普遍通过手机交友软件在本地或邻近城市寻找性伴侣，所感染的HIV-1序列多与其他经济发达地区(广东省、北京市和杭州市等)的HIV-1毒株序列存在较高同源性。 结论:浙江省嘉兴市和湖州市的HIV-1亚型多样，以CRF07_BC和CRF01_AE为主。该地区HIV-1传播网络特征复杂，其中高传播风险病例可能是导致浙江省北部区域HIV-1流行的关键因素，因此亟需深化传播网络监测体系，及时制订精准干预和防治策略。

目的:分析整合酶(IN)区主要耐药突变对HIV-1 CRF01_AE毒株耐药的影响，并比较与B亚型毒株的差异。方法:根据美国斯坦福大学HIV耐药数据库选择7个IN区突变或联合突变(T66K、F121Y、Q148K、N155H、G118R、R263K、Q148K/N155H)，通过无缝克隆同源重组及点突变的方法引入到HIV-1 B亚型感染性克隆pNL4-3和CRF01_AE感染性克隆pGX002的IN区，转染293T细胞包装病毒，在MT2细胞上扩大培养并测定感染性滴度。检测4种整合酶链转移抑制剂(INSTIs)，拉替拉韦(RAL)、埃替拉韦(EVG)、多替拉韦(DTG)、比昔格韦(BIC)对14株突变病毒的半抑制浓度(IC 50)及其与野生型病毒相比提高的倍数。 结果:成功构建携带7个IN区突变或联合突变的B亚型和CRF01_AE质粒，包装获得14株重组病毒，感染性滴度为10 4~10 6半数组织细胞感染剂量(TCID 50)/ml，在MT2细胞高效复制，上清液中HIV-1 P24抗原浓度可达830~2 700 ng/ml。5个突变或突变组合(T66K、F121Y、Q148K、N155H、Q148K/N155H)均可导致CRF01_AE和B亚型毒株对RAL和EVG高度耐药，与野生病毒相比IC 50分别提高200倍和2 000倍以上，相同突变导致RAL和EVG对CRF01_AE的IC 50提高的倍数均显著低于B亚型( P<0.01)。Q148K/N155H突变导致B亚型和CRF01_AE对DTG和BIC高度耐药，IC 50提高50倍以上，其他突变对DTG和BIC的药物敏感性几乎无影响。 结论:构建了基于CRF01_AE和B亚型的14株携带不同INSTI耐药突变的HIV-1毒株，5个突变可导致对RAL和EVG的高水平交叉耐药，同一突变导致B亚型毒株耐药程度显著高于CRF01_AE毒株。Q148K和N155H突变组合可导致DTG和BIC的高度耐药，表明DTG和BIC耐药的遗传屏障高，可有效抑制携带INSTI耐药突变的毒株，且无明显的亚型耐药差异。

目的:分析霍乱弧菌O1血清群El Tor产毒株基因组的重组特征。方法:在美国国立生物技术信息中心数据库中，选取分离时间从1937—2015年的292株霍乱弧菌O1血清群El Tor菌株完成图序列或草图序列，以菌株N16961的基因组序列为参照，使用snippy软件获得菌株的全基因组比对信息，利用ClonalFrameML软件对数据进行重组分析，比较大小染色体间重组数目及重组区域总长度的差异，以及不同分离地区菌株的基因组重组片段数目和总长度的差异。使用KOBAS分析工具对重组热点基因进行基因本体富集分析。结果:292株霍乱弧菌菌株中，发生基因重组163株（55.8%）；其中，归一化处理的小染色体重组片段数目 M（ P 25， P 75）为4.7×10 -6（9.3×10 -7，2.0×10 -5），大于大染色体[2.4×10 -6（3.4×10 -7，5.7×10 -6）]（ P<0.001）；小染色体重组区域占小染色体长度的比例 M（ P 25， P 75）7.1%×10 -5（3.7%×10 -6，4.8%×10 -4），大于大染色体[2.2%×10 -5（2.4%×10 -6，8.4%×10 -5）]（ P<0.001）。分离自非洲、亚洲、欧洲、北美洲和南美洲的菌株重组片段数目 M（ P25， P75）分别为23（1.0，33.0）、1.0（0.0，34.0）、6.0（2.0，13.0）、0.0（0.0，1.0）和29.5（6.8，56.8）（ P<0.001）；分离自各大洲的菌株重组区域总长度 M（ P25， P75）分别为233.0（4.0，461.0）、11.0（0.0，695.5）、56.0（4.0，111.0）、0.0（0.0，9.0）和347.5（132.8，1 323.5）bp（ P<0.001）。富集分析结果显示，62个重组热点编码基因的功能主要集中在趋化、趋性、对外界刺激的反应、受体活性和分子转导活性。 结论:霍乱弧菌El Tor大小染色体的重组片段数目及区域长度存在差别，不同大洲菌株重组片段数目及重组区域总长度不同。

目的:构建表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒。方法:设计携带酶切位点和无酶切位点的两对引物以扩增ccdBKan目的片段。分别将ccdBKan与质粒pBR322-Ad4-eGFP共转至电转感受态GB08red-gyr462构建两种表达ccdBKan基因的重组Ad4质粒。利用ccdB正反筛选系统与ExoCET/Red重组结合将HPV16E7基因插入Ad4的E1A区，构建表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒pBR322-Ad4-E1Amut-C16E7P，经酶切、测序验证。提取质粒pBR322-Ad4-EIAmut-C16E7P释放基因组，转染293T细胞以包装和扩增病毒，用病毒感染293T细胞，检测HPV16 E7基因在细胞内的转录水平和蛋白表达。重组病毒经肌肉接种BALB/C裸鼠，收集小鼠血清用于病毒中和实验。结果:成功构建表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒，并在293T细胞中成功包装出重组病毒。qRT-PCR和Western blotting验证了重组病毒HPV16 E7基因的成功表达，病毒中和实验结果提示经重组病毒免疫后的小鼠血清能够中和Ad4-HPV16E7。结论:成功构建了表达HPV16 E7基因的重组腺病毒株，为进一步研究HPV16 E7在癌症发病机制中的作用以及HPV感染相关癌症的治疗方法提供新的思路和依据，并且可能为HPV治疗性疫苗的研究探索提供了一种潜在策略。