目的 通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶 2(fucosyl-transferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系.方法 构建FUT2 慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000 将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2 包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2 细胞系.PCR鉴定FUT2 基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2 细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2 细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性.结果 成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2 细胞系,PCR验证显示,FUT2 基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中.HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA水平提高了 330 倍.99.9%的HEK-293T/FUT2 细胞表达H2 型人类组织血型抗原.GI.1 重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2 细胞产生很好的结合反应,EC50为 2.007 μg/mL.结论 建立了H2 型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1 型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法.

神经嵴细胞是脊椎动物胚胎发育过程出现的一个广泛迁移的多能干细胞群体,谱系追踪是有关其研究的重点.150多年来,神经嵴相关研究经历了从形态学观察到单细胞水平的转变.本文对同位素标记、嵌合体、活体染料、体外克隆分析、基因条件重组、单细胞测序等研究手段在神经嵴研究中的运用进行综述.

目的:了解1株人流感H3N2毒株的全基因组序列特征、遗传进化及生物学特性。方法:对浙江省丽水市分离的1株H3N2流感毒株进行全基因组测序，从美国国立生物信息中心(NCBI)和全球倡议分享流感数据库(GISAD)获取其他流感毒株基因组全序列，通过BioEdit7.0.9将该毒株8节段基因与其他序列比对，MEGA7.0软件邻接法构建进化树，并全面分析该毒株的进化、致病力和抗原性等特征。结果:测序得到该毒株为人流感分离株A/Homo sapien/China/LS340/2019（H3N2）株（LS340），LS340为典型的季节性人流感病毒，血凝素基因属于3C.2a1进化分支，具备人际传播能力，部分位点呈现高传播性和高致病性特征，对金刚烷胺耐药。与当季推荐疫苗株相比，抗原区出现涉及A、B两个表位3个位点突变。结论:LS340未出现重组、缺失等较大变异，但与当季推荐疫苗株相比已经发生抗原漂变，应及时更新疫苗，同时加强此类病毒变异监测，防止流感大流行发生。

目的:构建荷载第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶（PTEN）基因的溶瘤腺病毒验证其在前列腺癌中表达水平及靶向抗肿瘤效果。方法:挖掘公开数据库和利用Galaxy在线工具处理本中心去势抵抗性前列腺癌（CRPC）标本基因测序数据，分析PTEN基因在前列腺癌组织中的表达差异。收集2019年3月至2022年8月徐州医科大学附属医院79例前列腺癌患者的病理样本和临床信息，免疫组织化学法检测前列腺癌组织及癌旁组织中PTEN蛋白的表达。同源重组法构建溶瘤腺病毒ZD55-PTEN，细胞计数试剂盒（CCK-8）法、Hoechst-33258和划痕实验检测其靶向抗肿瘤效果。分别采用卡方检验和 t检验对定性资料和定量资料进行统计分析，不满足正态分布的数据采用Mann-Whitney U检验；Spearman分析PTEN表达水平与临床病理特征的关系。 结果:前列腺癌组织中PTEN表达水平明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（501例比52例， Z＝－19.25， P<0.05）；PTEN的mRNA表达水平与淋巴结转移（ n＝425， rs＝－0.98， P<0.05）和Gleason评分（ n＝497， rs＝－1.25， P<0.05）呈负相关。CRPC阶段PTEN缺失明显高于激素敏感性前列腺癌（HSPC）阶段（79例比125例， Z＝－0.89， P<0.05）。前列腺癌组织的PTEN蛋白缺失率高于癌旁组织（45.6%比16.5%， t＝10.98， P<0.01），术前血清PSA水平（ n＝79， rs＝－0.47， P<0.01）和术后Gleason评分（ n＝79， rs＝－0.31， P<0.05）与PTEN的表达呈负相关。PTEN缺失的前列腺癌患者，确诊时PSA水平（36例比43例， χ2＝12.22， P<0.05）和根治术后Gleason评分（36例比43例， χ2＝6.92， P<0.05）显著高于PTEN蛋白完整患者。成功构建溶瘤腺病毒ZD55-PTEN，ZD55-PTEN组细胞存活率低于对照组[ZD55-EGFP组（49.67±4.19）%、ZD55-PTEN组（29.33±3.84）%， t＝8.68， P<0.05]；细胞凋亡率高于对照组[PBS组（12.86±5.23）%、ZD55-EGFP组（48.18±4.22）%、ZD55-PTEN组（68.93±5.88）%， t＝5.90， P<0.05]；划痕愈合率低于对照组[PBS组（79.13±3.98）%、ZD55-EGFP组（61.02±4.73）%、ZD55-PTEN组（47.92±5.97）%， t＝6.34， P<0.05]。 结论:PTEN基因低表达于前列腺癌组织中，且具有抑制DU145细胞的增殖、迁移并诱导凋亡的功能。

目的:观察吞噬和运动蛋白3(ELMO3)在胰腺癌组织中的表达及与预后的关系，探讨ELMO3对胰腺癌细胞增殖及迁移侵袭能力的影响。方法:选取郑州大学附属洛阳中心医院病理科2011年3月至2019年2月存档的蜡块，免疫组织化学法测定ELMO3在49例胰腺癌及相应癌旁组织中表达，分析其与胰腺癌临床病理特征及预后间的关系。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测胰腺癌细胞株PANC-1、SW1990、BXPC-3及正常胰腺导管上皮细胞株HPDE6c-7中ELMO3 mRNA表达。胰腺癌细胞株PANC-1重组腺病毒转染ELMO3短发卡RNA(shRNA)沉默基因，RT-qPCR检测转染。细胞计数试剂盒(CCK-8)法及平板克隆实验检测PANC-1细胞增殖能力及克隆形成能力，细胞划痕试验及Transwell实验检测细胞体外迁移及侵袭能力。蛋白质印迹法(Western blot)检测PANC-1细胞株中细胞核增殖抗原(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的表达。采用单因素方差分析，组内比较采用LSD- t检验，组间比较采用配对或成组 χ2检验。 结果:ELMO3在胰腺癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织(73.5%比26.5%， χ2＝6.773， P<0.05)，其阳性表达与胰腺癌患者性别、年龄及肿瘤部位无相关( χ性别2＝0.131， χ年龄2＝1.838， χ肿瘤部位2＝0.490， P值均>0.05)，而与胰腺癌TNM分期、分化程度及肿瘤大小明显相关( χTNM分期2＝4.410， χ分化程度2＝11.769， χ肿瘤大小2＝7.762， P值均<0.05)。ELMO3阳性表达的胰腺癌患者中位生存期(MST)明显低于阴性表达者(8.203个月比19.337个月， χ2＝10.253， P<0.05)。3种胰腺癌细胞株中ELMO3表达水平分别为21.33±0.67、17.65±0.31、16.28±0.47，均高于HPDE6c-7细胞株中的2.01±0.10( FPANC-1＝45.069， FSW1990＝22.824， FBXPC-3＝19.477， P值均<0.05)，转染后PANC-1细胞内ELMO3表达量显著下降，细胞增殖能力、克隆形成能力及迁移侵袭能力均明显下降( P值均<0.05)，且Ki-67、PCNA蛋白表达水平显著降低，而Caspase-3表达量却明显增高，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:ELMO3在胰腺癌中表达上调，其高表达提示胰腺癌患者预后不良。沉默ELMO3可抑制胰腺癌细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭。

目的:构建携带含Krüppel样因子4(KLF4)基因的重组慢病毒载体，建立KLF4基因过表达的骨髓间充质干细胞株(BMSCs)，并观察颈动脉损伤后血管增生的变化。方法:以慢病毒为载体介导KLF4基因转染BMSCs。选用10周龄SD大鼠24只，随机分为3组，分别为假手术组、模型组、KLF4组(注入KLF4修饰的BMSCs细胞)。采用球囊导管构建大鼠颈动脉内皮损伤的动物模型，于14 d后股动脉放血处死大鼠，并采用苏木精-伊红(HE)染色法观察各组颈总动脉血管壁厚度变化及形态学变化；采用Griess法检测各组实验大鼠血清中一氧化氮(NO)的含量；采用蛋白质印迹法(Western blot)检测大鼠颈动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、KLF4蛋白的表达水平。组间比较采用单因素方差分析。结果:模型组内皮细胞增生高于假手术组(1.68±0.29比0.01±0.01， F＝244.345， P<0.05)，差异有统计学意义，而KLF4组内皮细胞增生低于模型组(0.14±0.01比1.68±0.29， F＝244.345， P<0.05)。模型组血清中NO浓度明显低于假手术组(7.22±1.40比21.29±1.83， F＝171.000， P<0.05)，差异有统计学意义，而KLF4组NO浓度明显高于模型组(16.34±1.33比7.22±1.40， F＝171.000， P<0.05)，差异有统计学意义。Western blot显示，KLF4/β-肌动蛋白(β-actin)在假手术组、模型组和KLF4组中的比值分别为0.564±0.015、0.626±0.023、0.916±0.042，差异有统计学意义( F＝125.121， P<0.05)；eNOS/β-actin在假手术组、模型组和KLF4组中的比值分别为0.852±0.043、0.383±0.017、0.707±0.014，差异有统计学意义( F＝223.879， P<0.05)。 结论:KLF4可正性调节eNOS的表达，从而增加血管中NO的浓度，通过抑制血管内皮细胞的迁移和增殖来抑制颈动脉损伤造成的血管狭窄。

目的:探讨双调蛋白（Areg）对小鼠急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的保护作用及其相关机制。方法:①动物实验：选择6~8周龄雄性C57BL/6小鼠，并按随机数字表法分为3组（ n＝10）：假手术组（Sham组）、ARDS模型组〔气管内滴注脂多糖（LPS）3 mg/kg建立小鼠ARDS模型〕和ARDS+Areg干预组〔LPS制模后1 h腹腔注射重组小鼠Areg（rmAreg）5 μg〕。于LPS制模后24 h处死小鼠，苏木素-伊红（HE）染色后光镜下观察肺组织病理学改变并进行肺损伤评分；测定小鼠氧合指数、肺湿/干质量比值；用二喹啉甲酸（BCA）法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中蛋白含量，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BALF中白细胞介素（IL-1β、IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子水平。②细胞实验：获取小鼠肺泡上皮细胞株MLE12细胞，培养后分成3组：空白对照组（Control组）、LPS组（LPS 1 mg/L）和LPS+Areg组（LPS刺激后1 h加入rmAreg 50 μg/L）。于LPS刺激后24 h收集细胞及培养液，用流式细胞仪检测MLE12细胞凋亡水平；蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测MLE12细胞磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）活化水平以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平。 结果:①动物实验：与Sham组相比，ARDS模型组小鼠肺组织结构破坏，肺损伤评分明显升高，氧合指数明显降低，肺湿/干质量比值明显增加，BALF中蛋白及炎症因子水平明显升高。与ARDS模型组相比，ARDS+Areg干预组小鼠肺组织结构破坏减少，肺间质充血、水肿及炎症细胞浸润均明显减少，肺损伤评分明显下降（分：0.467±0.031比0.690±0.034），氧合指数明显升高〔mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）：380.00±22.36比154.00±20.74〕，肺湿/干质量比值明显下降（5.40±0.26比6.63±0.25），BALF中蛋白及炎症因子水平明显降低〔蛋白（g/L）：0.42±0.04比0.86±0.05，IL-1β（ng/L）：30.00±2.00比40.00±3.65，IL-6（ng/L）：190.00±20.30比581.30±45.76，TNF-α（ng/L）：30.00±3.65比77.00±4.16〕，差异均有统计学意义（均 P<0.01）。②细胞实验：与Control组比较，LPS组MLE12细胞凋亡数量显著增多，MLE12细胞PI3K磷酸化水平、抗凋亡基因Bcl-2水平及促凋亡基因Bax水平增加。与LPS组比较，给予rmAreg处理后的LPS+Areg组MLE12细胞凋亡数量明显减少〔（17.51±2.12）%比（36.35±2.84）%〕，MLE12细胞表达PI3K/AKT磷酸化水平和Bcl-2表达水平显著增加（p-PI3K/PI3K：2.400±0.200比0.550±0.066，p-AKT/AKT：1.647±0.103比0.573±0.101，Bcl-2/GAPDH：0.773±0.061比0.343±0.071），Bax表达明显受抑制（Bax/GAPDH：0.810±0.095比2.400±0.200），差异均有统计学意义（均 P<0.01）。 结论:Areg可通过激活PI3K/AKT信号通路抑制肺泡上皮细胞凋亡进而减轻ARDS。

目的:应用下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术检测乳腺癌患者及高风险个体胚系基因突变，分析同源重组修复（homologous recombination repair，HR）通路基因突变状态与乳腺癌临床病理特征的相关性，以补充中国乳腺癌相关基因突变数据库。方法:本研究为横断面研究，收集2020年10月至2021年9月就诊于北京大学人民医院并自愿接受基因检测的350例乳腺癌患者和49例乳腺癌高风险个体的全血样本。应用NGS检测32个乳腺癌相关基因的胚系突变情况，统计乳腺癌患者发病年龄、肿瘤家族史、单/双侧肿瘤、Luminal分型（Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型和三阴性乳腺癌）、肿瘤大小、肿瘤转移情况等临床病理特征，采用χ2检验和Fisher精确概率检验分析HR通路基因突变与临床病理特征的相关性。结果:在350例乳腺癌患者中，64例（18.3%）携带基因致病突变（包括致病和疑似致病两类突变），包括47例（13.4%）BRCA1/2突变，16例（4.6%）非BRCA1/2基因突变，1例（0.3%）BRCA2和FANCL突变。在49例乳腺癌高风险个体中，7例（14.3%）携带基因致病突变，包括6例（12.3%）BRCA1/2突变，1例（2%）ATM突变。BRCA1/2致病突变与乳腺癌发病年龄相关（18%，8.7%，χ2=6.346， P=0.012），发病年龄≤45岁的乳腺癌患者突变频率较高。HR通路基因突变（包括致病、疑似致病和临床意义不明确的三类突变）与单/双侧肿瘤（49.5%，68.4%，χ2=4.841， P=0.028）和Luminal分型（45.7%，62.2%，32%，60%，χ2=12.004， P=0.007）具有相关性，双侧乳腺癌、Luminal B型和三阴性乳腺癌患者突变频率较高。 结论:乳腺癌高风险个体BRCA1/2致病突变频率与乳腺癌患者相近，对高风险个体进行BRCA1/2检测有利于指导乳腺癌的筛查和预防。早发性乳腺癌、双侧乳腺癌、Luminal B型和三阴性乳腺癌患者HR通路基因突变频率较高，应及早进行HR通路基因检测，为乳腺癌的诊疗预后和风险评估提供实验室依据。

目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

X-连锁低磷血症是最常见的遗传性低磷血症，致病基因是位于X染色体上与内肽酶同源的磷酸盐调节基因(PHEX基因)，呈显性遗传。PHEX基因的缺陷使血成纤维细胞生长因子(FGF)23水平上调，继而近端肾小管上皮细胞的膜结合钠-磷协同转运体NaPi-Ⅱa和NaPi-Ⅱc发生降解以及1α-羟化酶表达被抑制、24-羟化酶活性被增强，最终导致临床表现为肾磷酸盐丢失、维生素D代谢及骨矿化异常的佝偻病/骨软化症。诊断该病有赖于临床症状、影像学检查及实验室结果的综合判断，确诊该病后应尽早且终身予以磷酸盐合剂及骨化三醇替代治疗，必要时加用重组人生长激素改善身高，新药抗FGF23单克隆抗体Burosumab的出现具有较好的应用前景与研究价值。