目的 基于网络药理学和实验研究探讨青光安Ⅱ号方对青光眼视神经的保护作用机制.方法 通过TCMSP数据库筛选青光安Ⅱ号方成分靶点,在GeneCards、Disgenet、CTD数据库挖掘青光眼相关靶点,进而筛选青光安Ⅱ号方作用于青光眼的靶点;制作蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络取其交集,并通过GO分析和KEGG富集分析.建立自发性慢性高眼压DBA/2J青光眼小鼠模型,将C57BL/6J小鼠设置为空白组(等体积蒸馏水),DBA/2J小鼠随机分为模型组(等体积蒸馏水)、益脉康组[0.31 g/(kg·d)]、青光安Ⅱ号方低浓度组[0.85 g/(kg·d)]、青光安Ⅱ号方中浓度组[1.7 g/(kg·d)]、青光安Ⅱ号方高浓度组[3.4 g/(kg·d)],每组 8只,每日灌胃 1 次.干预 4周后,触式眼压笔监测小鼠眼压;HE染色观察小鼠视网膜形态结构;Western blot检测沉默信息调节因子-1(silent information regulator type-1,SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(peroxisome proliferation-activated receptor-γ-coactivator 1α,PGC-1α)的蛋白表达水平;qRT-PCR检测SIRT1、PGC-1α的mRNA表达水平.结果 从青光安Ⅱ号方共筛选得到 101 个活性成分和 245 个相关靶点,2 412个青光眼疾病相关基因靶点;药物-活性成分-靶点相互作用最强的 5个靶点分别是前列腺素内过氧化物合成酶 2、核受体共激活因子 2、胃蛋白酶原Ⅱ、前列腺素内过氧化物合成酶 1 以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG);PPI网络显示较强的靶点是SIRT1、PPARG;GO分析和KEGG富集分析得到细胞衰老、IL-17 等信号通路.与给药前相比,给药后用药组眼压显著降低(P<0.01).给药后,与空白组相比,模型组眼压显著升高(P<0.01),视网膜中SIRT1、PGC-1α mRNA表达量和蛋白表达量均显著降低(P<0.01);与模型组相比,用药组眼压显著降低(P<0.01),SIRT1、PGC-1α mRNA表达量和蛋白表达量均显著升高(P<0.01).与益脉康组和青光安Ⅱ号方低浓度组相比,青光安Ⅱ号方中、高浓度组SIRT1、PGC-1α mRNA表达量和SIRT1蛋白表达量显著升高(P<0.01);与青光安Ⅱ号方低浓度组相比,青光安Ⅱ号方高浓度组PGC-1α蛋白表达量均显著上升(P<0.01).与青光安Ⅱ号方中浓度组相比,青光安Ⅱ号方高浓度组PGC-1α mRNA表达量和蛋白表达量显著升高(P<0.01).结论 青光安Ⅱ号方可有效调控SIRT1/PGC-1α信号通路,抑制RGC的丢失,主要在氧化应激、细胞衰老等方面对青光眼视神经发挥保护作用.

青光眼是不可逆性致盲性眼病,视神经萎缩是其特征性表现,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的凋亡是青光眼视神经萎缩的病理基础.磷脂酰肌醇 3-激酶(phos-phatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路作为一条促存活通路,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等活动,活络效灵丹等中药可通过靶向PI3K/Akt通路上凋亡信号分子抑制RGCs凋亡,保护视神经.丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路可调节炎症、凋亡、氧化等病理活动,槲皮素等通过抑制该通路激活,减轻RGCs炎症反应及氧化应激等损伤.低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是真核细胞对缺氧反应的起始转录因子,过量的HIF-1 会促发凋亡和新生血管产生.疏肝通窍方等可通过抑制 HIF-1 的表达,提高RGCs存活率.Rho激酶(Rho-associated kinase,ROCK)信号通路参与调节细胞骨架重组,改变小梁细胞结构,影响房水排出.青光安Ⅱ号方等具有抑制ROCK通路活化功能,可降低眼压,延缓青光眼进展.Wnt/β-catenin信号通路是细胞生长、组织重塑和器官形成的重要途径,可导致多种神经退行性疾病发生,中药复方活血方通过下调该通路相关因子可减轻RGCs丢失.本文总结了中药干预青光眼RGCs凋亡的关键基因和信号通路,寻找相关信号通路的靶向激动剂或阻断剂,以期更好指导临床和后续研究.

目的 通过建立慢性高眼压(EIOP)大鼠模型,观察青光安Ⅱ号方对慢性EIOP大鼠视网膜热休克蛋白(HSP)的影响.方法 将40只SD大鼠随机抽取6只作为空白组,其余均采用烧灼巩膜表浅静脉法建立大鼠慢性高眼压模型,监测造模后大鼠的眼压,使其维持在25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上持续8周视为造模成功.将造模成功的大鼠按随机数字表法分为5组,每组6只,分别为:模型组、青光安Ⅱ号方低、中、高剂量组、益脉康组,并开始灌胃.灌胃后14 d、28 d分别处死大鼠,光镜下观察各组视网膜形态学改变,Western blot检测HSP27、HSP60、HSP70的表达.结果 Western blot:三种HSP在正常视网膜中均有表达;在EIOP模型中,三种HSP在视网膜中的表达均上升,差异有统计学意义(P<0.05).灌胃后14 d:青光安Ⅱ号方低、中、高剂量组、益脉康组大鼠的视网膜HSP27、HSP6及HSP70的表达均增多,与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),其中,HSP27的表达,青光安Ⅱ号方高剂量组效果优于益脉康组,差异有统计学意义(P<0.05);HSP60及HSP70的表达各灌药组比较,差异无统计学意义(P>0.05).灌胃后28 d:各灌药组HSP表达量与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中,青光安Ⅱ号方高剂量组效果优于益脉康组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 (1)烧灼巩膜表浅静脉法建立大鼠EIOP模型成功率较高,眼压能有效的维持在高眼压状态;(2)EIOP大鼠视网膜中HSP27,HSP60,HSP70的表达均会应激性增多;(3)与模型组比较,青光安Ⅱ号方能促进实验性EIOP大鼠HSP27、HSP60、HSP70的表达;(4)通过实验观察初步说明青光安Ⅱ号方高剂量组对慢性高眼压大鼠视神经的保护作用优于益脉康分散片.

目的 观察青光安Ⅱ号方有效组分对青光眼模型DBA/2J小鼠视网膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白表达的影响.方法 将8只(16只眼)雌性C57BL/6小鼠设为空白组(A组),48只(96只眼)雌性DBA/2J小鼠随机分成6组,每组8只(16只眼),分别为:模型组(B组)、益脉康分散片组(C组)、青光安Ⅱ号汤剂组(D组)、青光安Ⅱ号有效组分低浓度组(E组)、青光安Ⅱ号有效组分中浓度组(F组)、青光安Ⅱ号有效组分高浓度组(G组),B、C、D、E、F、G组DBA/2J小鼠喂养38周龄建立青光眼模型后开始干预,干预4周后Western blot法检测DBA/2J小鼠视网膜中RhoA、ROCK及Caspase-3蛋白的相对表达量.结果 干预4周后,与A组比较,B组RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白相对表达量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C、D、E、F、G组RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白表达减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D、E、F组RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白相对表达差异无统计学意义(P>0.05);与C、D组比较,G组RhoA、ROCK、Caspase-3蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05).结论 青光安Ⅱ号方有效组分能抑制Rho/ROCK信号通路及凋亡相关蛋白Caspase-3的表达,其中高浓度青光安Ⅱ号方有效组分效果优于益脉康分散片和青光安Ⅱ号方汤剂,推测青光安Ⅱ号方及其有效组分治疗青光眼的机制可能与其抑制Rho/ROCK信号通路及视网膜细胞凋亡相关蛋白表达有关.

目的 观察青光安Ⅱ号方对谷氨酸诱导损伤的RGC-5细胞中核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)、BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3,BNIP3)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的影响.方法 体外培养RGC-5细胞,分为4组:空白组、模型组、含药血清组和阻断剂组.模型组、含药血清组和阻断剂组予以谷氨酸诱导细胞损伤,模拟青光眼对神经节细胞的损伤,含药血清组加入青光安Ⅱ号方含药血清,阻断剂组加入KC7F2进行HIF-1α通路的阻断.以CCK-8法摸索含药血浆以及谷氨酸的最佳干预浓度;采用Hoechst法检测各组细胞的凋亡情况;Western blot检测NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白表达情况;比色法检测SOD、MDA的表达情况.结果 CCK8法确定青光安Ⅱ号方5倍组含药血清为实验量,确定谷氨酸的最佳干预浓度为200μM.与空白组比较,模型组NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD、MDA表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,含药血清组、阻断剂组NF-κB、HIF-1α、BNIP3和SOD的表达显著降低(P<0.05);含药血清组与阻断剂组的NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD及MDA差异均无统计学意义(P>0.05).结论 青光安Ⅱ号方对NF-κB具有抑制作用,进而抑制了HIF-1α相关通路的激活,减弱了由于氧化应激所致RGC-5细胞的凋亡,对RGC具有保护作用.

目的:基于网络药理学探讨青光安Ⅱ号方治疗青光眼的分子机制.方法:通过TCMSP筛选和预测青光安Ⅱ号方潜在的入血活性成分和作用靶点;通过疾病基因数据库挖掘青光眼相关的靶点;采用STRING数据库绘制成分-靶点和疾病-靶点的PPI网络,并提取这两个网络的交集;采用DAVID 6.8数据库分析筛选关键靶点与作用机制.结果:在TCMSP数据库共检索出与青光安Ⅱ号方相关的潜在活性成分808个,根据药代动力学参数筛选获得102个潜在入血活性成分,并检索出与这些成分相关的靶点1 018个;从疾病基因数据库检索并筛选得到与青光眼直接相关的靶点82个;成分靶点和疾病靶点PPI网络取交集后得到以乙酰胆碱受体、肾上腺素受体为主的14个关键蛋白;这些蛋白主要涉及到神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路等.结论:青光安Ⅱ号方能通过乙酰胆碱受体、肾上腺素受体等14个关键蛋白治疗青光眼,其机制可能与降低眼压相关.

目的 采用数据挖掘方法分析彭清华教授治疗青光眼的用药规律.方法 收集2013年9月至2021年6月于彭清华教授门诊就诊的青光眼患者病历,将患者症状、证候、用药录入Excel 2010,根据朱文锋教授提出的证素辨证理论对证素进行标准化处理,采用古今医案云平台(V2.3)进行复方中药的频次与关联规则分析.结果 共纳入符合标准的青光眼患者103例,包含103首处方,常用中药20味,主要有茯苓、赤芍、当归、柴胡、甘草等.所有药物中,寒性药物频次最多,为513次,温性药物为400次,平性药物为270次;甘味药物为719次,辛味药物为468次,苦味药物为433次;药物归经中,肝经药物频次最多,为680次,脾经药物500次,肺经药物477次;药物功效以活血化瘀和利水渗湿最多,分别为184次和164次.药物关联规则共获得16项药物组合,按置信度从大到小排列,最常用的药物组合分别为车前子-赤芍、泽泻-赤芍等.药物聚类分析共获得5个聚类方.结论 彭清华教授治疗青光眼常用药物为茯苓、赤芍、当归、柴胡、甘草、车前子、川芎、泽泻等,常用治法为活血利水法.

目的 观察青光安Ⅱ号方对眼压已控制的青光眼气阴两虚血瘀证患者的疗效.方法 120例眼压已控制的青光眼气阴两虚血瘀证患者随机分为对照组和治疗组各60例,治疗组中原发性开角型青光眼(POAG)患者32例,原发性闭角型青光眼(PACG)患者28例;对照组中POAG患者25例,PACG患者35例.对照组予以降眼压及对症治疗,治疗组在对照组的基础上加用青光安Ⅱ号方治疗,每日1剂,分2次口服.分别于治疗前1天及治疗1、3、6个月,比较两组患者最佳矫正视力、视野[包括静态视野的平均敏感度(MS)、平均缺损(MD)、丢失方差平方根(sLV)]、眼压、视觉诱发电位[诱发电位潜伏时(LP100)和诱发电位振幅(AP100)]、中医证候积分(包括视盘色淡、腰膝酸软、身体疲乏、舌质暗或有瘀点、脉细涩积分)、视网膜神经纤维层厚度及视盘形态;分别于治疗前1天及治疗6个月时进行进展期青光眼干预研究(AGIS)评分,比较不同类型(POAG与PACG)、不同年龄段(≤40岁、41～50岁、51～60岁、≥61岁)、不同程度视野缺损(轻度、中度、严重)患者AGIS评分.治疗6个月后继续随访6个月,观察患者视野疗效巩固率.结果 两组患者治疗前1天及治疗1、3、6个月时最佳矫正视力、眼压、视盘和周边不同方位视网膜神经纤维层厚度、杯盘比值和盘沿面积、LP100、AP100水平组间及组内比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).与本组治疗前1天及治疗1个月时比较,治疗组治疗6个月时MS升高,MD、sLV降低(P＜0.05);与对照组同时间比较,治疗组治疗6个月时MS升高,MD、sLV降低(P＜0.05).治疗组POAG与PACG患者治疗6个月时较本组治疗前1天AGIS评分明显降低,且均低于对照组治疗6个月时(P＜0.05).治疗组治疗6个月时41～60岁患者AGIS评分较治疗前1天明显降低,且均低于同时间对照组(P＜0.05);治疗组中度视野缺损与严重视野缺损患者治疗6个月时AGIS评分较治疗前1天明显降低,也低于同时间对照组(P＜0.05).治疗组治疗3、6个月时,视盘色淡、腰膝酸软、身体疲乏、舌质暗或有瘀点、脉细涩积分均低于本组治疗前和同时间对照组(P＜0.05).随访6个月,治疗组视野巩固率为75.93％,对照组为36.54％,治疗组视野巩固率高于对照组(P＜0.01).结论 青光安Ⅱ号方可改善眼压已控制的青光眼气阴两虚血瘀证患者视野和中医证候,并能提高视野巩固率.

目的 观察青光安Ⅱ号方及其有效组分对DBA/2J小鼠视网膜细胞中Ras、MEK与ERK蛋白表达的影响,探讨其对视神经保护的作用机制.方法 将8只雌性C57BL/6J小鼠作为正常对照组(A组),采用随机数字表法将48只雌性DBA/2J小鼠分为6组:模型组(B组)、阳性对照组(C组)、青光安Ⅱ号方汤剂组(D组)、青光安Ⅱ号方有效组分低剂量组(E组)、青光安Ⅱ号方有效组分中剂量组(F组)、青光安Ⅱ号方有效组分高剂量组(G组),每组8只.A、B组给予12.91 mL/(kg·d)蒸馏水;C组给予0.31 g/(kg·d)益脉康分散片;D组给予9.67 g/(kg·d)青光安Ⅱ号方汤剂;E、F、G组分别给予0.85、1.70、3.40 g/(kg·d)青光安Ⅱ号方有效组分.每4周进行眼压测量以及裂隙灯检查;灌胃4周后取视网膜组织行Western blot检测各组小鼠视网膜Ras、MEK与ERK蛋白的表达水平.结果 C57BL/6J小鼠不同时相点的眼压不随年龄增长而变化(P>0.05);DBA/2J小鼠眼压在第18～38周高于C57BL/6J小鼠(P<0.05).裂隙灯检查C57BL/6J小鼠眼前段均未见明显异常;DBA/2J小鼠随周龄增长逐渐出现角膜钙化、虹膜基质萎缩、瞳孔后粘连等眼前节病变.与A组比较,B组Ras、MEK、ERK蛋白表达水平均降低(P<0.05);与B组比较,C、D、E、F、G组Ras蛋白表达水平均升高(P<0.05),G组MEK、ERK蛋白表达水平均升高(P<0.05);与C组比较,G组Ras蛋白表达水平升高(P<0.05);与D组比较,G组MEK蛋白表达水平升高(P<0.05);与E、F组比较,G组Ras蛋白表达水平升高(P<0.05).结论 青光安Ⅱ号方及其有效组分低、中、高剂量对DBA/2J小鼠视网膜Ras、MEK、ERK蛋白可起到不同程度的上调作用,以青光安Ⅱ号方有效组分高剂量组效果最佳.

目的:观察青光安Ⅱ号方对DBA/2J小鼠视网膜中RhoA mRNA、ROCK mRNA、Caspase?3 mRNA及Bcl?2 mRNA转录的影响.方法:使用48只DBA/2J小鼠随机平均分成模型组、青光安Ⅱ号汤剂组、青光安Ⅱ号有效组分低、中、高浓度组及阳性对照组(益脉康分散片组)6组,同时使用8只C57BL/6J小鼠作为空白组,DBA/2J小鼠喂养到38周后形成青光眼模型,干预4周后,采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real?time,PCR)检测DBA/2J小鼠视网膜中RhoA mRNA、ROCK mRNA、Caspase?3 mRNA及Bcl?2 mRNA的转录情况.结果:干预4周后,在RhoA mRNA、ROCK mRNA和Caspase?3 mRNA的转录中,与空白组相比,其它6组的相对表达量均升高,模型组、益脉康分散片组及青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组有统计学差异(P<0.05);与模型组相比较,其它6组的相对表达量均低于模型组,其中RhoA mRNA转录中的青光安Ⅱ号方汤剂组和青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组有统计学差异(P<0.05);ROCK mRNA和Caspase?3 mRNA的转录中,模型组与青光安Ⅱ号方有效组分中、高浓度组统计学有差异(P<0.05);在Bcl?2 mRNA转录中,与空白组比较,其它6组相对表达量均下降,模型组、青光安Ⅱ号方汤剂组和青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组统计学有差异(P<0.05);青光安Ⅱ号方有效组分中、高浓度组的Bcl?2 mRNA的相对表达量均高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05).结论:高浓度青光安Ⅱ号方可能是通过抑制Rho/ROCK信号通路而减弱了视网膜神经节细胞(RGCs)中Caspase?3的转录,激活了Bcl?2的表达,从而减弱了RGCs的凋亡.