目的:探讨LRRK2G2019S位点突变对驱铁处理后小胶质细胞活化的影响及其机制。方法:（1）利用人类诱导多能干细胞（IPSC）经造血祖细胞（HPC）分化产生小胶质细胞，免疫荧光染色进行鉴定，利用蛋白纯化技术获取α-突触核蛋白（α-syn）A53T突变蛋白。（2）将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+甲磺酸去铁胺（DFO）组，分别加入磷酸盐缓冲液（PBS）、1 μmol/L纯化的α-syn A53T突变蛋白、1 μmol/L纯化的α-syn A53T突变蛋白+30 mmol/L DFO作用24 h。采用比色法检测细胞Fe 2+浓度，Western blotting实验检测细胞Rab35蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平，实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测细胞白细胞介素（ IL） -6、肿瘤坏死因子α（ TNF-α）、转化生长因子β（ TGF-β）mRNA的表达。将3组小胶质细胞培养上清液（MCS）转移到SH-SY5Y细胞中，采用流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞的凋亡情况。（3）双向DNA测序检测1 μmol/L纯化的α-syn A53T突变蛋白处理后小胶质细胞富亮氨酸重复激酶2（ LRRK2）基因的突变。将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+GSK3357679A组，分别加入对应的药物处理24 h（LRRK2抑制剂GSK3357679A浓度为10 nmol/L），采用Western blotting实验检测细胞LRRK2蛋白的表达。将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+GSK3357679A、α-syn+GSK3357679A+DFO组，分别加入对应的药物处理24 h后采用Western blotting实验检测细胞Rab35蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞内ROS水平，RT-PCR检测细胞 IL-6、 TNF-a、 TGF-β mRNA的表达。（4）将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+雷帕霉素（RAPA）组，分别加入对应的药物处理24 h（自噬诱导剂RAPA的浓度为50 nmol/L），采用Western blotting实验检测细胞Rab35、P62、微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞内ROS水平，RT-PCR检测细胞 IL-6、 TNF-α、 TGF-β mRNA的表达。（5）将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+Rab35组，分别加入对应的药物处理24 h（Rab35过表达质粒的浓度为1 μg/mL），采用Western blotting实验检测细胞Rab35、P62、LC3Ⅱ蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞内ROS水平，RT-PCR检测细胞 IL-6、 TNF-α、 TGF-β mRNA的表达。 结果:（1）免疫荧光染色检测显示小胶质细胞神经元核蛋白（NeuN）表达阴性、离子钙结合适配分子1（Iba1）表达阳性、LRRK2呈高表达。成功构建PcDNA3.1-SNCA-A53T表达质粒并纯化获得α-syn A53T突变蛋白。（2）α-syn组细胞Fe 2+浓度高于对照组，α-syn+DFO组细胞Fe 2+浓度低于α-syn组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。对照组、α-syn组、α-syn+DFO组细胞Rab35蛋白、 TGF-β mRNA的表达依次降低， IL-6、 TNF-a mRNA的表达依次增加，差异均有统计学意义（ P<0.05）。对照组、α-syn组、α-syn+DFO组小胶质细胞ROS水平、SH-SY5Y细胞凋亡率均依次增加。（3）双向DNA测序显示α-synA53T突变蛋白刺激后小胶质细胞LRRK2G2019S突变最明显。与对照组比较，α-syn组细胞LRRK2蛋白的表达增高；与α-syn组比较，α-syn+GSK3357679A组细胞LRRK2蛋白的表达降低，差异有统计学意义（ P<0.05）。与对照组比较，α-syn组细胞Rab35蛋白、 TGF-β mRNA的表达降低， IL-6、 TNF-a mRNA的表达增高；与α-syn组比较，α-syn+GSK3357679A组细胞Rab35蛋白、 TGF-β mRNA的表达增高， IL-6、 TNF-a mRNA的表达降低；与α-syn+GSK3357679A组比较，α-syn+GSK3357679A+DFO组细胞Rab35蛋白、 TGF-β mRNA的表达降低， IL-6、 TNF-a mRNA的表达增加，差异均有统计学意义（ P<0.05）。α-syn组细胞ROS水平高于对照组，α-syn+GSK3357679A组细胞ROS水平低于α-syn组，α-syn+GSK3357679A+DFO组细胞ROS水平高于α-syn+GSK3357679A组。（4）与对照组比较，α-syn组细胞Rab35、LC3Ⅱ蛋白、 TGF-β mRNA的表达降低，P62蛋白、IL-6、 TNF-a mRNA的表达升高；与α-syn组比较，α-syn+RAPA组细胞Rab35、LC3Ⅱ蛋白、 TGF-β mRNA的表达升高，P62蛋白、 IL-6、 TNF-a mRNA的表达降低，差异均有统计学意义（ P<0.05）。α-syn组细胞ROS水平高于对照组和α-syn+RAPA组。（5）与对照组比较，α-syn组细胞Rab35、LC3Ⅱ蛋白、 TGF-β mRNA的表达降低，P62蛋白、 IL-6、 TNF-a mRNA的表达升高；与α-syn组比较，α-syn+Rab35组细胞Rab35、LC3Ⅱ蛋白、 TGF-β mRNA的表达升高，P62蛋白、 IL-6、 TNF-a mRNA的表达降低，差异均有统计学意义（ P<0.05）。α-syn组细胞ROS水平高于对照组和α-syn+Rab35组。 结论:在驱铁处理条件下，LRRK2G2019S能通过抑制Rab35等自噬相关蛋白诱发小胶质细胞活化，Rab35有望成为干预神经炎症反应的关键因素。

目的 通过生物信息学方法探究牙周炎与铁死亡之间的关系.方法 从基因表达数据库(GEO)中下载数据集GS16134,在铁死亡数据库(FerrDb)中下载铁死亡的驱动和抑制基因.利用R软件对数据进行标准化处理,"limma"包筛选牙周炎中差异表达的基因(P<0.05).利用基因本体(GO)以及京都基因和基因组百科全书(KEGG)对差异基因进行分析,确定其主要的功能及通路.构建蛋白互作网络,筛选关键mRNA.结果 一共筛选出50个在牙周炎牙龈组织样本和健康牙龈组织样本中存在差异性表达的铁死亡调控基因.GO功能和KEGG通路结果表明,差异基因主要参与氧化应激反应,并集中在Xc-系统通路及铁代谢通路.结论 铁死亡调控基因在牙周炎组织样本中存在差异表达,这些基因主要在氧化应激和铁代谢通路上发挥作用,表明二者之间存在相关性.推测铁死亡可能通过脂质过氧化以及铁代谢异常对炎症,甚至对牙槽骨骨改建造成影响,本研究为牙周炎的发生发展机制提供了新的见解和思路.

目的:分析在脓毒症诱导的小鼠肺上皮细胞系MLE-12凋亡和小鼠急性肺损伤(ALI)过程中铁死亡的作用,并探讨谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)在这一过程的调节作用.方法:体外实验1将MLE-12细胞分为对照组、铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1)组、脂多糖(LPS)组和LPS+Fer-1组,以考察铁死亡参与LPS诱导的MLE-12细胞凋亡;实验2将细胞分为:载体组和GPX4组,以考察GPX4对LPS刺激诱导的MLE-12细胞损伤的影响;实验3将细胞分为:si-WTAP+si-NC组和si-WTAP+si-GPX4组,以考察Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)对GPX4驱动的铁死亡影响.LPS刺激MLE-12细胞建立体外模型,然后将细胞用Fer-1和转染GPX4过表达质粒、WTAP特异性siRNA(si-WTAP)、GPX4特异性siRNA(si-GPX4)进行处理.分别通过CCK-8测定细胞活力,流式细胞术分析细胞凋亡,DCFH-DA测定细胞内活性氧(ROS)水平,荧光探针测定细胞内Fe2+水平和Western blot分析GPX4和WTAP表达水平.体内实验将小鼠随机分为4组:对照组、假手术组、盲肠结扎穿刺(CLP)12 h组和CLP 24 h组,每组12只.进行H&E染色以评估小鼠的肺损伤,并采用试剂盒法检测肺匀浆中的铁含量、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平.结果:与对照组相比,随着LPS暴露时间的延长,细胞中ROS水平和Fe2+水平显著增加(P<0.05),铁死亡标志物GPX4的蛋白表达逐渐降低,WTAP蛋白水平以及WTAP/GPX4比例显著增加(P<0.05).相对于LPS组,在LPS+Fer-1组中细胞活力显著增加(P<0.05),细胞凋亡百分率、ROS水平和Fe2+水平显著降低(P<0.05).与载体组相比,GPX4组细胞中GPX4表达及细胞活力显著增加(P<0.05),细胞凋亡百分比、ROS水平和Fe2+水平显著降低(P<0.05).与si-WTAP+si-NC组相比,si-WTAP+si-GPX4组MLE-12细胞中ROS水平和Fe2+水平显著增加(P<0.05).与假手术组相比,CLP 12 h组和CLP 24 h组小鼠肺组织学评分和肺匀浆中铁含量、MDA水平和WTAP蛋白表达显著升高(P<0.05),肺组织中GPX4蛋白表达和GSH水平显著降低(P<0.05).结论:WTAP介导的m6A修饰可能是GPX4的上游目标,并通过降低GPX4水平以促进脓毒症诱导的MLE-12细胞凋亡和小鼠ALI过程中的铁死亡.