目的:应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法:选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型，设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3，制备AAV，病毒滴度达1～4×10 13 GC/ml；感染WD肝细胞，72 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出其中活性最高者sgRNA1，构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT，应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞，测序和T7E1酶切检测模板修复效率；用HT特异性引物行PCR，验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。 结果:Sanger测序结果显示，sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%]，与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%]，差异有统计学意义( P<0.05)。进一步用HT进行基因修正，能检出特异性修正后的ATP7B基因；二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。 结论:AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。

3'-核酸修复外切酶1 (three prime repair exonuclease 1,TREX1),也称为DNase Ⅲ,是胞质中主要的3'-5'限制性核酸外切酶,在哺乳动物的大多数组织和细胞类型中表达.TREX1表达的核酸酶活性对于维持先天免疫系统识别自身DNA的免疫耐受发挥重要的作用,这避免了一些游离的DNA在胞质中不断累积而引起的先天免疫的过度激活和自身抗体的大量产生.cGAS-STING通路是先天免疫系统抵御病原体入侵和维持细胞内环境稳态的重要手段.当细胞质出现来源于细胞核泄漏或病原体的DNA时,除非被核酸酶TREX1清除,否则将激活胞质中的DNA感受器环鸟苷酸-腺苷酸合酶cGAS,并引发下游的Ⅰ型干扰素级联反应.人源TREX1基因的突变会引起一系列自身免疫性疾病的发生.例如,Aicardi-Goutières综合征、家族性冻疮样狼疮、系统性红斑狼疮及脑白质营养不良相关视网膜病变.同时,TREX1作为先天免疫通路的上游调控因子,在HIV-1的免疫逃逸、肿瘤的免疫耐受和细胞衰老过程中发挥重要作用.本综述主要围绕TREX1介导的免疫调控在自身免疫性疾病、HIV-1感染、肿瘤和细胞衰老进程中的作用进行阐述,为相关疾病的临床治疗提供重要的理论依据.

[目的]以嗜酸嗜热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的DHH超家族核酸酶(Saci0542)为例,研究其核酸外切酶活性特点,为阐明其在DNA代谢中的具体功能提供生化基础.[方法]将嗜酸嗜热硫化叶菌DHH超家族核酸酶Saci0542基因在大肠杆菌中重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯的重组蛋白;利用荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定Saci0542的酶学特征.[结果]重组表达的DHH超家族核酸酶Saci0542具有典型的单链核酸特异性的3'-5'外切酶活性.进一步酶学特征表征结果如下:酶活性依赖于二价金属离子Mn2+,而Ca2+、Mg2+、Zn2+等二价金属离子对活性没有明显的促进作用;Saci0542在pH 5.5-10的广泛范围内均表现出较高酶活性;高于200 mmol/L的NaCl强烈抑制酶活性;最适反应温度为50-55℃;末端磷酸基团抑制3 '-5 '外切酶活性.[结论]本研究证实,Saci0542是一种Mn2+依赖型3 '-5 '外切酶,酶活性与NrnA核酸酶相似,可能在细胞内负责DNA修复或RNA的降解再循环利用.