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基于BLI技术的BamAβ-barrel结合化合物检测方法的建立
编辑人员丨2024/6/1
目的 以革兰阴性菌外膜蛋白折叠辅助因子关键蛋白BamA为靶蛋白,基于生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术建立化合物与BamA蛋白β折叠结构域(BamAβ-barrel)结合活性的评价方法,为建立靶向BamA蛋白的抗革兰阴性菌先导物奠定基础.方法 应用BLI方法检测BamAβ-barrel与已知的阳性化合物darobactin的结合活性.原核表达并纯化带有His标签的大肠埃希菌BamAβ-barrel蛋白,使用表面活性剂LDAO对其进行复性和折叠;使用生物素标记折叠和未折叠蛋白,并结合到超级链霉*亲和素(super streptavidin,SSA)生物传感器,然后检测蛋白与不同浓度的darobactin结合信号的变化,同时做无蛋白或darobactin稀释液对照;空白对照采用未结合生物素化的BamAβ-barrel蛋白的传感器,检测上述系列稀释样品.相应信号采用Steady state analysis方式拟合分析,计算平衡常数(KD)值.结果 成功获得高纯度的折叠状态BamAβ-barrel蛋白,通过BLI技术检测到折叠状态的BamAβ-barrel与阳性化合物darobactin具有良好结合活性且呈现浓度依赖性,R2为0.9998,KD值为(2.2E-06±8.0E-08)M.结论 基于BLI技术成功建立了折叠状态的BamAβ-barrel-化合物结合活性的评价方法,为后续BamA蛋白靶向性抗革兰阴性菌抗生素的发现建立基础.
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编辑人员丨2024/6/1
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基于高分辨质谱的darobactin的结构解析策略
编辑人员丨2023/8/19
目的 Darobactin(达罗巴汀)是一类经核糖体合成的翻译后修饰肽,该七肽具有独特的稠和双环结构,本研究建立了系统的基于高分辨质谱的darobactin组分的结构解析策略.方法 依据文献中报道的在高能碰撞裂解(HCD)和碰撞诱导裂解(CID)模式下获得的一级及二级高分辨质谱数据,以碎片离子结构式的方式呈现了darobactin A的裂解途径,并修正了文献中部分碎片离子结构和质荷比的错误.针对特殊的双环结构,本文提出了基于生物合成路径的"逆向裂解途径"来确证1位和3位色氨酸之间因醚键断裂而生成的特征离子,并首次解析出包含特殊碳碳键的色氨酸.赖氨酸的碎片离子,为判断5位色氨酸被其他氨基酸(如精氨酸)取代提供了直接证据.结果 建立了系统的darobactin A的结构解析策略,并以darobactin B/D/E的碎片离子加以验证,从理论上推导了其他darobacitn组分如C和F的特征离子.结论 本文为快速判定darobactin新组分及其前体肽的结构提供了研究基础.
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编辑人员丨2023/8/19
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1株发光杆菌Photorhabdus asymbiotica的次级代谢产物研究
编辑人员丨2023/8/5
目的 研究1株发光杆菌Photorhabdus asymbiotica抗革兰阴性菌的活性次级代谢产物.方法 以抗革兰阴性菌活性为导向,采用大孔吸附树脂、MCI柱色谱,以及反相高效液相色谱等多种分离纯化技术,利用HR-ESIMS和NMR等波谱学方法,分离Photorhabdus asymbiotica发酵液中的化合物并鉴定其结构.结果 从菌株Photorhabdus asymbiotica中获得3个次级代谢产物,并鉴定为darobactin(1)、环(L-色氨酸-L-脯氨酸)(2)和环(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)(3).其中化合物1对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌均具有显著的抗菌活性.结论 化合物1为发光杆菌Photorhabdus asymbiotica中主要的抗革兰阴性菌活性化学成分.
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编辑人员丨2023/8/5
