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全人源EGFR单抗的筛选和鉴定
编辑人员丨6天前
目的:制备全人源表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体,为基于人EGFR靶点的肿瘤免疫调节治疗提供基础制剂。方法:采集110例胸部肿瘤(肺癌102例,乳腺癌8例)患者外周血,构建噬菌体单链抗体库。经噬菌体展示后筛选阳性克隆,测序并构建全长轻重链表达载体质粒,共转染HEK293。通过亲和层析获得纯化抗体,抗原抗体免疫反应测定抗体特异性和敏感性,生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术测定抗体亲和力和流式细胞技术(fluorescence activating cell sorter,FACS)检测对肿瘤细胞系EGFR结合活性。结果:成功构建肺癌单链抗体噬菌体库,抗体库库容≥10 8,筛选获得两株单抗,分别为BTHG17-1,BTHG17-2,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定结合抗原敏感性为10 ng/mL,亲和力在10 -8 mol/L水平,两抗体结合相同表位,可特异性结合野生型EGFR和突变体EGFRvⅢ蛋白,具有结合肺癌和神经胶质瘤细胞活性。 结论:获得较高亲和力全人源EGFR单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),具有EGFR(包括EGFRVⅢ)特异性,为EGFR靶点封阻和免疫导向治疗研究提供一种新抗体工具。
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编辑人员丨6天前
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基于髓样分化蛋白-2靶点探讨熊果酸抗脓毒症的作用机制
编辑人员丨6天前
目的:以髓样分化蛋白-2(MD-2)为研究载体,探讨熊果酸抗脓毒症的作用机制。方法:应用生物膜干涉技术测定熊果酸与MD-2的亲和力,基于分子对接技术测定熊果酸与MD-2的键合方式。RPMI 1640培养基培养巨噬细胞Raw 264.7,细胞密度达到80%~90%时进行传代培养,取第2代细胞进行实验,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测8、40和100 mg/L熊果酸对细胞活性的影响。将细胞分为空白组、内毒素组(LPS 100 μg/L)和熊果酸组(加入8、40或100 mg/L熊果酸后给予100 μg/L LPS处理)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)评价熊果酸对一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-1β)等细胞因子释放的影响;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)评价熊果酸对TNF-α、IL-6、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)mRNA表达的影响;蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测熊果酸对内毒素-Toll样受体4/MD-2-核转录因子-κB(LPS-TLR4/MD-2-NF-κB)通路中蛋白表达的影响。结果:熊果酸可能进入MD-2的疏水性空腔,通过疏水键与MD-2的氨基酸残基结合表现出与蛋白的较高亲和力〔解离常数(KD)=1.43×10 -4〕。随着熊果酸浓度升高,细胞活性略有降低,8、40和100 mg/L熊果酸处理的细胞活性分别为96.01%、94.32%和92.12%,与空白组(100%)比较差异均无统计学意义。与空白组比较,LPS组细胞因子水平明显升高;而8、40和100 mg/L熊果酸处理可使细胞因子水平显著下降,且浓度越高作用越明显〔100 mg/L熊果酸与LPS组比较:IL-1β(μmol/L):38.018±0.675比111.324±1.262,IL-6(μmol/L):35.052±1.664比115.255±5.392,TNF-α(μmol/L):39.078±2.741比119.035±4.269,NO(μmol/L):40.885±2.372比123.405±1.291,均 P<0.01〕。与空白组比较,LPS组TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2的mRNA表达均明显升高,LPS-TLR4/MD-2-NF-κB通路中MD-2、髓样分化因子88(MyD88)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)和iNOS的蛋白表达明显上调。与LPS组比较,100 mg/L熊果酸与MD-2蛋白作用,可使TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2的mRNA表达明显下降〔TNF-α(2 -ΔΔCt):4.659±0.821比8.652±0.787,IL-6(2 -ΔΔCt):4.296±0.802比11.132±1.615,IL-1β(2 -ΔΔCt):4.482±1.224比11.758±1.324,iNOS(2 -ΔΔCt):1.785±0.529比4.249±0.811,COX-2(2 -ΔΔCt):5.591±1.586比16.953±1.651,均 P<0.01〕,并显著下调LPS-TLR4/MD-2-NF-κB通路中MD-2、MyD88、p-NF-κB p65和iNOS的蛋白表达(MD-2/β-actin:0.191±0.038比0.704±0.049,MyD88/β-actin:0.470±0.042比0.875±0.058,p-NF-κB p65/β-actin:0.178±0.012比0.571±0.012,iNOS/β-actin:0.247±0.035比0.549±0.033,均 P<0.01)。但3组间NF-κB p65的蛋白表达差异无统计学意义。 结论:熊果酸抑制细胞因子和介质的释放及表达,通过阻断MD-2蛋白调控LPS-TLR4/MD-2-NF-κB信号通路,从而起到抗脓毒症的作用。
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编辑人员丨6天前
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基于光学检测的分子间相互作用表征技术研究进展
编辑人员丨1个月前
分子间相互作用的表征技术是阐明细胞生物学事件、了解疾病发生机制、辅助药物研发的有力手段.近年来,分子间相互作用的表征技术发展迅速,不断向着高灵敏度、高通量、极短时间、极低检测限的方向发展.本文对表面等离子体共振、生物膜干涉、背向散射干涉以及微量热泳动这 4 种常见的、基于光学检测的分子间相互作用表征技术的原理、特点及最新应用进展进行了综述与比较,为分子间相互作用表征技术的选择提供参考.
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编辑人员丨1个月前
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抗TREM2抗体的制备及生物学活性的初步研究
编辑人员丨2024/7/20
目的 制备抗髓系细胞触发受体 2(TREM2)抗体并初步探究其生物学活性.方法 采用杂交瘤筛选的方法,获得稳定分泌抗TREM2 抗体的杂交瘤细胞株,并对杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行筛选,选择结合效果最佳的单克隆抗体进行人源化改造得到嵌合抗体;对嵌合抗体进行进一步的人源化改造,采用酶联免疫吸附法(ELISA)及流式细胞术(FACS)检测人源化抗体的抗原抗体结合活性;采用生物膜干涉技术(BLI)检测人源化抗体与人TREM2结合动力学;通过基于报告基因的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)生物学活性测定方法,检测人源化抗体的依赖细胞介导的细胞毒效应;使用免疫缺陷小鼠对人源化抗体进行体内药效实验.结果 利用杂交瘤技术成功筛选到稳定表达抗TREM2 抗体的杂交瘤细胞株,对杂交瘤细胞株进行进一步人源化改造,获得纯度高于 95%的人源化抗体h7B6-11,抗体h7B6-11 与TREM2-His蛋白具有高度亲和性,且对 293T-TREM2 细胞的ADCC活性明显强于对照抗体.体内药效实验结果显示,h7B6-11 与程序性死亡受体 1(PD1)抗体联合用药抑制肿瘤生长效果明显.结论 抗体h7B6-11具有高度亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为新一代肿瘤免疫治疗的抗体药物.
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编辑人员丨2024/7/20
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基于BLI技术的BamAβ-barrel结合化合物检测方法的建立
编辑人员丨2024/6/1
目的 以革兰阴性菌外膜蛋白折叠辅助因子关键蛋白BamA为靶蛋白,基于生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术建立化合物与BamA蛋白β折叠结构域(BamAβ-barrel)结合活性的评价方法,为建立靶向BamA蛋白的抗革兰阴性菌先导物奠定基础.方法 应用BLI方法检测BamAβ-barrel与已知的阳性化合物darobactin的结合活性.原核表达并纯化带有His标签的大肠埃希菌BamAβ-barrel蛋白,使用表面活性剂LDAO对其进行复性和折叠;使用生物素标记折叠和未折叠蛋白,并结合到超级链霉*亲和素(super streptavidin,SSA)生物传感器,然后检测蛋白与不同浓度的darobactin结合信号的变化,同时做无蛋白或darobactin稀释液对照;空白对照采用未结合生物素化的BamAβ-barrel蛋白的传感器,检测上述系列稀释样品.相应信号采用Steady state analysis方式拟合分析,计算平衡常数(KD)值.结果 成功获得高纯度的折叠状态BamAβ-barrel蛋白,通过BLI技术检测到折叠状态的BamAβ-barrel与阳性化合物darobactin具有良好结合活性且呈现浓度依赖性,R2为0.9998,KD值为(2.2E-06±8.0E-08)M.结论 基于BLI技术成功建立了折叠状态的BamAβ-barrel-化合物结合活性的评价方法,为后续BamA蛋白靶向性抗革兰阴性菌抗生素的发现建立基础.
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编辑人员丨2024/6/1
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二氢青蒿素结合SERCA2b诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡的机制研究
编辑人员丨2024/5/11
目的 探讨二氢青蒿素(DHA)与肌浆/内质网钙ATP酶(SERCA)的结合位点及其通过线粒体途径诱导人结肠癌HCT-116细胞凋亡的作用机制.方法 分别于不同浓度(0,10,20,40μmol/L)DHA环境中培养HCT-116细胞24h后,用Western blotting检测细胞中SERCA2蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖情况;行Hoechst核染色;用JC-1探针检测细胞线粒体膜电位.通过LeDock分子对接方法,预测DHA与SERCA的结合位点.基于生物膜干涉技术,将合成的Ile315与Thr316位点突变后的SERCA2b突变蛋白和非突变蛋白分别与小分子DHA进行结合检测.结果 Western blotting与CCK-8检测结果显示,随着DHA浓度升高,SERCA2蛋白表达水平显著下降,细胞增殖显著降低,并呈剂量相关(P<0.01).Hoechst核染色显示,DHA诱导了HCT-116细胞核变圆、固缩.JC-1探针检测结果表明,在DHA处理4h内,线粒体膜电位逐渐降低,其后线粒体膜电位则出现明显降低.分子对接预测提示DHA与Thr316形成氢键相互作用,与Ile315则有疏水相互作用.进一步的生物膜干涉技术提示DHA与SERCA2b非突变蛋白结合信号良好,而与Ile315与Thr316位点突变后的SERCA2b突变蛋白结合信号较差.结论 DHA可直接与SERCA2b的Ile315与Thr316位点结合,并通过线粒体途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡.
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编辑人员丨2024/5/11
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环索奈德通过靶向HIV-1衣壳蛋白六聚体调节其体外装配
编辑人员丨2024/1/13
多肽CAI在HIV-1衣壳蛋白(CA)C末端的结合口袋可用来筛选CA蛋白装配调节剂.采用均相时间分辨荧光技术(HTRF)筛选399个化合物,发现1个小分子化合物环索奈德(ciclesonide)能够竞争性抑制十二肽CAI与CA蛋白C末端的结合,其半数抑制浓度IC50值为6.06 μmol/L.生物膜干涉技术(BLI)测量环索奈德与CA蛋白(单体和六聚体)的结合,环索奈德与CA六聚体的亲和力为159 nmol/L,远远大于其与CA单体的亲和力(KD=1.68 mmol/L).衣壳蛋白体外装配实验表明,环索奈德能促进CA蛋白的装配,且具有浓度依赖性.分子模拟分析环索奈德与CA蛋白的结合模式,显示环索奈德与CA六聚体的相互作用发生在六聚体相邻亚基N末端-C末端的界面上,并与H67和L211两个残基形成氢键.研究表明,环索奈德是一种潜在的HIV-1衣壳装配调节剂.
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编辑人员丨2024/1/13
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基于药物靶标识别中药活性成分的研究方法及应用
编辑人员丨2023/8/26
中药小分子与生物体内靶标蛋白的相互作用是中药发挥药理作用的基础,现代科学技术的发展和药物作用靶标的揭示为中药活性成分的研究提供了新的技术和手段.基于已知的药物作用靶标,阐明中药的有效成分及其作用机制已成为中药学研究和发展的重要方向.基于化学和生物技术与计算机虚拟筛选技术两大视角,总结了亲和超滤质谱技术、分子生物色谱技术、磁珠富集技术、等离子共振技术、生物膜干涉技术、分子对接技术、药效团模型和机器学习8种基于药物靶标识别中药活性成分的研究方法与应用现状,以期补充传统药物发现的方法,为该领域研究提供借鉴与参考.
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编辑人员丨2023/8/26
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基于HT-SELEX筛选的节球藻毒素-R适配体的鉴定
编辑人员丨2023/8/6
节球藻毒素-R(nodularin-R,NOD-R)是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素.然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法.本文利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术结合高通量测序(HT-SELEX),筛选出NOD-R特异的高亲和力适配体.生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术对适配体的鉴定结果表明,适配体H62与NOD-R之间的亲和力最高,达到了168 nM.而且,该适配体不与其他毒素结合,具有较高的特异性.以上结果表明,适配体H62有望作为NOD-R检测新方法——适配体生物传感器的分子识别元件.
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编辑人员丨2023/8/6
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京大戟提取物pekincnin D通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡
编辑人员丨2023/8/6
目的:通过观察京大戟提取物pekinenin D对肝癌SMMC-7721细胞体外生长的抑制作用,初步探讨其诱导凋亡的可能机制.方法:采用MTT法分析不同剂量的pekinenin D对体外培养SMMC-7721细胞增殖的影响;原位末端标记法(TUNEL)和AnnexinV/PI双染法检测对细胞凋亡的作用;应用流式细胞术分析对细胞周期的影响;采用RT-PCR检测pekinenin D对PI3K/AKT/mTOR mRNA的影响;应用生物膜干涉技术(BLI)分析pekinenin D与PI3K启动子是否存在相互作用.结果:MTT结果显示3.988ug/ml的pekinenin D可显著抑制SMMC-7721细胞的增殖,抑制率过半,并且呈剂量依赖性.AnnexinV/PI双染法结果显示,随着pekinenin D剂量的增加,SMMC-7721细胞的凋亡率明显增加,与对照组比较,差异具有明显统计学意义.TUNEL法检测结果表明,0.249、0.997、3.988 ug/ml的pekinenin D作用于SMMC-7721细胞后均可诱导肝癌细胞凋亡,凋亡指数(AI)随着药物浓度的升高明显增加.流式细胞术分析显示,0.249、0.997、3.988 ug/ml的pekinenin D均可使细胞被阻滞于S期,RT-PCR显示pekinenin D显著下调SMMC-7721细胞中PI3K,AKT,mTOR的mRNA表达量.采用BLI技术分析发现pekinenin D与PI3K的启动子存在一定亲和力.结论:pekinenin D具有抑制肝癌细胞增殖及诱导凋亡的作用,显著下调SMMC-7721细胞中PI3K,AKT,mTOR的mRNA表达,其机制可能是与PI3K的启动子相结合从而抑制PI3 K/AKT/mTOR信号通路有关.
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编辑人员丨2023/8/6
