背景:目前临床皮肤创面愈合仍然是一大难题,而具有免疫调节功能的生物材料成为当下组织修复领域的研究前沿,因此,研究具有免疫调节功能的创面敷料具有重要意义.目的:制备不同构型精氨酸改性壳聚糖水凝胶,评估其促大鼠创面愈合的能力.方法:①体外实验:采用EDC/NHS体系分别合成了单纯左旋精氨酸、单纯右旋精氨酸及左旋精氨酸与右旋精氨酸联合改性的壳聚糖材料,以醛基化的四臂聚乙二醇为交联剂,通过席夫碱反应构建精氨酸改性壳聚糖水凝胶,依次命名为CS-L、CS-D、CS-DL水凝胶,表征水凝胶的理化性能.将3种水凝胶浸提液分别与成纤维细胞共培养,采用CCK-8法及活死染色评价水凝胶的细胞相容性,通过划痕实验评价水凝胶对成纤维细胞迁移能力的影响.将3种水凝胶分别与大鼠红细胞悬液共孵育,评估水凝胶的血液相容性.将3种水凝胶浸提液分别与巨噬细胞RAW264.7共培养,评估水凝胶对细胞产生NO及极化分型的影响.②体内实验:采用随机数字表法将36只成年SD大鼠分为4组,每组9只,在每只大鼠背部制作2个2 cm×2 cm的全层皮肤缺损创面,对照组创面滴加生理盐水,CS-L组、CS-D组、CS-DL组创面分别滴加对应的水凝胶,包扎固定.术后定期观察创面愈合情况;术后3,10,21 d取材,进行苏木精-伊红染色;术后10 d取材,进行M2型巨噬细胞免疫荧光染色.结果与结论:①体外实验:扫描电镜下可见3种水凝胶内部均有明显的互穿网络结构,孔径范围70-200 μm;3种水凝胶均具有良好的溶胀性能、降解性能、自愈合性能及合适的机械强度.3种水凝胶具有良好的细胞相容性与血液相容性,可促进成纤维细胞的迁移.3种水凝胶均具有促进巨噬细胞极化的能力,其中CS-D水凝胶促巨噬细胞极化能力最强;CS-L水凝胶具有促进巨噬细胞产生NO的能力.②体内实验:术后3,10 d,CS-L组、CS-D组大鼠创面愈合率高于对照组(P<0.05);术后21 d,3种水凝胶组大鼠创面愈合率高于对照组.苏木精-伊红染色显示,术后3 d,各组大鼠创面组织中都有大量炎性细胞浸润,伴有新生血管及成纤维细胞;术后10 d,对照组创面中仍有较多炎性细胞浸润,其他3组炎症情况有所改善,特别是CS-D组炎症细胞减少较为明显;术后21 d,各组创面上皮修复良好,CS-L组和CS-D组基本无炎症细胞浸润,对照组仍有少量炎症细胞浸润.免疫荧光染色显示,CS-D组M2型巨噬细胞数量多于其他3组(P<0.05).③结果表明:不同构型精氨酸改性壳聚糖水凝胶可以通过不同机制促进创面愈合.

目的:运用组织工程学方法和纳米技术对牛心包进行处理,研究其免疫原性,以期制备免低疫原性的组织工程补片.方法:采用明胶再基质化、碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(简称EDC/NHS)交联和高速搅拌复乳溶剂挥发法对牛心包进行相关处理,之后植入大鼠皮下进行观察,通过HE染色对比纳米组、交联组、脱细胞组和新鲜组四组植入前后的组织形态学改变,并对各组心包片进行机械性能、厚度、含水量和钙含量检测;免疫组织化学法检测心包片表面CD4的沉积.结果:肉眼观察到大鼠皮下降解率纳米组明显低于脱细胞组,与交联组相当,脱细胞组降解较快;抗张强度测定结果显示,纳米组抗张强度与交联组(P=0.76)及脱细胞组(P=0.61)相比较差异无统计学意义,但远低于新鲜组(P＜0.01);钙含量纳米组远低于新鲜组(P ＜0.001),与交联组相当;免疫组化结果显示各组心包片表面均有明显的CD4沉积,纳米组的排斥反应远低于新鲜组,与交联组相当.结论:组织工程学方法和纳米技术结合制备的纳米心包片具有低免疫原性,低降解率和抗钙化的优良特性.与交联组相比,纳米微球的嵌合并未明显影响心包片的机械性能和免疫原性,有望成为构建组织工程补片缓释模型的理想载体.

背景:传统角膜支架材料的强度和生物相容相差,采用天然角膜组织成分的胶原和硫酸软骨素制备人工角膜尚未见报道.目的:制备具有缓释生长因子、高强度和透光性、良好生物相容性的胶原/硫酸软骨素/成纤维生长因子复合人工眼角膜.方法:将不同浓度(1％、5％、10％)的胶原溶液采用流延法制备为再生胶原膜,通过生物力学测试筛选出5％胶原溶液制备的再生胶原膜生物力学性能最优,用于制备复合膜.通过EDC-NHS交联法将不同质量浓度(2,20,80 g/L)的硫酸软骨素固定于再生胶原膜上,得到胶原/硫酸软骨素复合膜,通过透光率筛选出20 g/L硫酸软骨素制备的胶原/硫酸软骨素复合膜透光性最好,用于制备载生长因子复合膜.将胶原/硫酸软骨素复合膜与不同质量浓度(5,25,50 mg/L)的成纤维细胞因子10溶液共混于PBS中24 h,制备载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜,将其浸泡于PBS中,ELISA法检测上清液中生长因子水平.将再生胶原膜、胶原/硫酸软骨素复合膜及载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜分别与角膜上皮细胞共培养48 h,MTT法检测细胞增殖,筛选最佳载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜.将载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜与角膜上皮细胞共培养,48 h后,采用共聚焦显微镜观察细胞形态;72 h后,采用扫描电镜观察细胞形态.结果与结论:①成纤维生长因子10的释放量随复合膜中初始装载生长因子水平的增加而增加.同时,3种复合膜上的生长因子释放缓慢,并在72 h时分别达到11％、23％和30％,释放行为符合药代动力学过程;②通过MTT实验确定复合膜最佳生长因子负载质量浓度为25 mg/L;③共聚焦显微镜及扫描电镜显示,载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜可促进角膜上皮细胞的黏附、生长及增殖;④结果表明,载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜有望成为一种优良的人工角膜支架材料.

为提高丝素表面接枝共聚乙烯基单体的效率从而通过酶法制备丝素蛋白基吸水复合材料,首先借助EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)交联体系进行丙烯酸(AA)与丝素蛋白(SF)的接枝,通过丙烯酸上的羧基与丝素蛋白上的氨基反应使丝素蛋白上引入双键,提高丝素蛋白表面的接枝聚合反应位点.之后再进行辣根过氧化物酶(HRP)体系催化丝素蛋白与丙烯酸、丙烯酰胺(AM)以及交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)的共聚反应,最终生成再生丝素吸水复合材料.通过多种方法测定丝素溶液中游离氨基含量的变化、接枝前后溶液中丙烯酸含量的变化,分析不同条件下制得的丝素膜材料的形态,评价复合材料的吸水、保水、重复吸水和缓释性能.实验结果表明,丝素蛋白能通过EDC/NHS接枝引入丙烯酸单体;丙烯酸接枝后的和未接枝的丝素蛋白与丙烯酸和丙烯酰胺共聚制得的吸水复合材料相比,具有更好的吸水、保水性和重复吸水性能,较快的包载能力和较好的热稳定性能.

目的 采用交联技术制备鱼鳔膜材料,检测其理化性能及细胞毒性.方法 取鱼鳔经脱细胞处理后随机分为两组,交联组采用碳二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide,EDC]/N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)法交联处理后,行表面制孔及冻干处理;未交联组仅行表面制孔及冻干处理.观测两组材料理化性能,包括扫描电镜观察微观结构,电子万能材料试验机测试力学性能(拉伸强度及断裂伸长率),接触角测量仪检测材料亲水性,乙醇浸润法测定材料孔隙率,体外降解性能及热稳定性检测,以及红外光谱分析支架成分.取小鼠成纤维细胞L929与两组材料浸提液培养,细胞检测试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)测定细胞毒性.结果 扫描电镜观测两组支架均具有多孔结构,且表面粗糙.与未交联组相比,交联组材料拉伸强度明显增高、断裂伸长率降低、孔隙率增大,差异有统计学意义(P＜0.05);接触角差异无统计学意义(P＞0.05).两组材料降解趋势一致,最初7d内降解较快,之后趋于平缓;各时间点交联组降解率低于未交联组,差异均有统计学意义(P＜0.05).差示扫描量热法检测显示,交联组材料变性温度为(75.2±1.3)℃,高于未交联组的(68.5±0.4)℃,差异有统计学意义(t=4.586,P=0.002).红外光谱分析,与未交联组相比,交联组生成了酰胺键中新的C=O键和N-H键,并且未引入其他新的基团.CCK-8法检测示,交联组及未交联组A值与阳性对照组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 经EDC/NHS法交联处理获得的鱼鳔膜材料具有优良的理化性能,无细胞毒性,有望作为硬膜修复材料.

该研究制备了一种高灵敏度的黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)单克隆抗体并基于该抗体建立间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competition enzyme-linked immunosorbent assay,ic-EHSA),用于中药材中AFB1污染的高通量、快速筛查,以保障中药用药安全性.研究中以改进的肟化法修饰AFB1后,用EDC-NHS法偶联载体蛋白获得AFB1完全抗原,更加简便且减少环境污染.并利用加大免疫剂量、多种方式注射等对Balb/c雌鼠进行免疫,最终制备得AFB1单克隆抗体.通过对其免疫特性进行鉴定,结果显示该AFB1单克隆抗体属于IgG2b型免疫球蛋白,其灵敏度(IC50)可达0.15 μg·L-1,亲和力为2.81×l08L·mol-1,与AFB2,AFG1和AFG2交叉反应率分别为35.07％,8.75％,1.15％,且与其他类真菌毒素几乎不存在交叉反应.基于该高灵敏度、高特异性抗体建立了ie-ELISA法,并用于中药材酸枣仁样品的检测.采用基质匹配的标准曲线进行计算,AFB1在0.05～0.58 μg·L-1线性良好(R2=0.992),加样回收率为88.00％～119.0％,检测限为1.69 μg·kg-1.采用所建立的方法测定了33批酸枣仁样品中AFB1的污染情况,其污染水平为3.62～206.58 μg·kg-1,其检测结果与UHPLC-MS/MS测定结果的线性相关系数为0.996,并且无假阳性和假阴性情况,表明所建立的ic-ELISA准确、可靠,可为中药材酸枣仁中AFB1污染的快筛提供一种简便、有效的技术手段,同时可为其他中药中AFB1的检测与监控提供参考.