蜕皮是罗氏沼虾重要的生理过程,为了探究罗氏沼虾蜕皮周期中内分泌调控与蜕皮通路中相关基因在蜕皮周期中的表达模式,阐明罗氏沼虾蜕皮的分子调节通路.本研究测定了罗氏沼虾肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮周期内蜕皮相关酶活性(谷氨酰胺合成酶,β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶)与蜕皮激素含量,并通过RT-qPCR分析了蜕皮信号通路中Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1 以及RXR、ECR和MIH基因在罗氏沼虾不同蜕皮周期内的表达模式.酶活测定结果表明,谷氨酰胺合成酶在血淋巴组织中活力高于肝胰腺组织(P<0.05);β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶在肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮前期的活力远高于蜕皮后期(P<0.05).在肝胰腺中几丁质酶在蜕皮后期活力显著高于其他时期(P<0.05).肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮激素含量在蜕皮间期最低,蜕皮后期达到最高,呈上升趋势.通过PCR扩增与测序验证获得了Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1 基因ORF全长序列,Mr-ETHR基因ORF全长 1 173 bp,编码 390 个氨基酸;Mr-FTZ-F1 基因ORF全长为 1 206 bp,编码 401 个氨基酸.荧光定量结果表明Mr-ETHR、Mr-RXR和Mr-ECR在蜕皮后期表达量达到最高,而Mr-FTZ-F1 在蜕皮前期表达量达到最高.Mr-MIH在蜕皮间期表达量达到最高,蜕皮后期表达量最低,呈下降趋势.聚类分析及相关性分析结果表明Mr-ETHR与Mr-RXR和Mr-ECR表达模式相近且呈极显著正相关(r=0.7030,P<0.01;r=0.8680,P<0.01),Mr-FTZ-F1 和Mr-MIH表达模式相近且呈极显著正相关(r=0.6665,P<0.01),而Mr-FTZ-F1 与Mr-ECR和Mr-ETHR呈极显著负相关(r=-0.8339,P<0.01;r=-0.6275,P<0.01).研究表明罗氏沼虾的蜕皮过程受谷氨酰胺合成酶、β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶的调节,Mr-ETHR、Mr-RXR、Mr-ECR、Mr-FTZ-F1 和Mr-MIH参与调控罗氏沼虾蜕皮过程,Mr-ETHR、Mr-RXR和Mr-ECR在蜕皮信号通路中起正向调节作用,而Mr-FTZ-F1 和Mr-MIH起负调节作用.本研究结果为甲壳动物蜕皮信号通路下游基因的蜕皮调控机制研究提供了基础资料.

[目的]本研究旨在从转录组水平筛选和分析西方蜜蜂Apis mellifera工蜂不同时期蛹对低温胁迫反应的差异表达基因(DEGs).[方法]将西方蜜蜂工蜂封盖后3 d预蛹以及封盖后6和9 d蛹分别置于低温环境(20℃)和最适发育温度(35℃)中4 h,分别作为处理组和对照组,通过转录组学技术筛选低温处理组与对应的对照组之间的DEGs,并进行GO功能分类和KEGG通路分析.利用RT-qPCR分别对封盖后3 d预蛹以及封盖后6和9d蛹的8,6和5个DEGs的表达谱进行验证.[结果]与对照组相比,封盖后3 d预蛹以及封盖后6和9 d蛹受低温胁迫后的DEGs分别有220,50和26个;GO功能分类发现,DEGs富集数最多的条目为代谢进程、细胞进程、催化活性和结合,封盖后3 d预蛹的DEGs在生物学进程调控、细胞部分和细胞器等有较多富集.KEGG通路分析显示,处理组和对照组间西方蜜蜂各日龄DEGs在整体概述图、氨基酸代谢、信号转导、运输和分解代谢有富集.封盖后3 d预蛹以及封盖后6和9 d蛹受低温胁迫后共有的DEG3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1基因PDK1上调表达,同时富集在自噬-动物、mTOR和FoxO信号通路.低温胁迫后,封盖后3 d预蛹的胰岛素受体底物1-B基因IRS1-B和Kruppel同源物1基因Kr-h1上调表达,而核激素受体FTZ-F1基因Ftz-F1与蜕皮启动激素基因Eth显著下调表达,说明封盖后3 d预蛹响应低温细胞自噬和蜕皮受到抑制程度更大.在低温胁迫后封盖后6d蛹中与昆虫角质层着色与免疫相关的酪氨酸羟化酶基因TyHyd下调表达;与对照组相比,在低温胁迫后封盖后9 d蛹中DEGs最少,说明在3个蛹期中,其受低温的影响较小.[结论]本研究测定了西方蜜蜂3个不同发育阶段蛹响应低温的DEGs,结果显示大部分DEGs为阶段特有,说明西方蜜蜂不同发育阶段响应低温的机制不同.一些共有DEGs以及阶段特有DEGs的功能研究和其作用机制是进一步研究蜜蜂对低温响应机制的重点内容,为探究蜜蜂蛹期响应低温胁迫的分子机制提供了基础数据.

[目的]本研究旨在揭示昆虫蜕皮激素信号通路上的关键核受体因子FTZ-F1在斜纹夜蛾Spodoptera litura响应虫螨腈和辛硫磷胁迫中的作用机制.[方法]使用生物信息学方法鉴定斜纹夜蛾FTZ-F1基因,并进行序列比对及系统发育树构建;将LC30浓度辛硫磷和虫螨腈浸叶处理的桑叶分别喂食斜纹夜蛾3龄幼虫,并分别收集取食药叶后1,12,24,36和48 h时存活的幼虫,使用qRT-PCR技术检测幼虫体内SlFTZ-F1的表达水平;使用RNAi技术沉默SlFTZ-F1 基因,并使用qRT-PCR技术检测注射dsRNA后SlFTZ-F1的表达水平;将LC30浓度虫螨腈和辛硫磷浸叶处理的桑叶分别喂食沉默了 SlFTZ-F1的斜纹夜蛾3龄幼虫,喂食后24和48 h统计斜纹夜蛾幼虫死亡率;选取8个斜纹夜蛾谷胱甘肽S-转移酶(S1GST)基因,使用qRT-PCR技术检测沉默了 SlFTZ-F1基因的斜纹夜蛾幼虫这些S1GST基因的表达水平.[结果]斜纹夜蛾SlFTZ-F1开放阅读框长1 665 bp,编码555个氨基酸,等电点为6.39,理论分子量61.77 kD,SlFTZ-F1具有DNA结合域、FTZ-F1 box及配体结合域;系统发育分析表明,SlFTZ-F1与草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的SfFTZ-F1聚为一个亚分支.与ddH2O处理的对照相比,LC30浓度虫螨腈处理后1,24和36 h以及LC30浓度辛硫磷处理后24和36 h,斜纹夜蛾3龄幼虫SlFTZ-F1的表达量均显著上调.与注射dsGFP的对照组相比,斜纹夜蛾幼虫在注射dsSlFTZ-F1后48 h SlFTZ-F1基因的表达量显著下降;分别将LC30浓度虫螨腈和辛硫磷处理的桑叶喂食沉默了 SlFTZ-F1的斜纹夜蛾3龄幼虫,48 h时与对照组相比斜纹夜蛾幼虫死亡率分别显著升高22％和28％;沉默SlFTZ-F1的斜纹夜蛾幼虫8个SlGST基因的表达量均显著下降.[结论]虫螨腈及辛硫磷显著诱导斜纹夜蛾幼虫SlFTZ-F1基因表达,沉默SlFTZ-F1后斜纹夜蛾幼虫对虫螨腈和辛硫磷的敏感性显著升高,解毒酶SlGST基因的表达受到显著抑制,说明发育相关的转录因子FTZ-F1在斜纹夜蛾响应常用杀虫剂胁迫中发挥了重要作用.

目的 对淡色库蚊抗性转录因子FTZ-F1蛋白进行原核表达并鉴定.方法 对转录因子FTZ-F1蛋白进行生物信息学分析,包括蛋白的理化性质,二级结构及三维同源模型.采用PCR技术扩增FTZ-F1基因,比对分析后选取FTZ-F1基因保守区和功能区片段,片段长度为1122bp,然后将其连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1,再转化入感受态细胞BL21(DE3)后用IPTG诱导重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1的表达,运用SDS-PAGE和Western blot初步鉴定重组蛋白FTZ-F1的表达,采用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化和增加蛋白的量,用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白FTZ-F1的表达.结果 FTZ-F1蛋白有744个氨基酸,相对分子质量为79.57×103.1％琼脂凝胶鉴定PCR扩增为单一条带,大约为2 240 bp,测序结果表明重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1构建正确.采用SDS-PAGE检测重组蛋白FTZ-F1,结果表明蛋白FTZ-F1在原核表达系统中主要以可溶性形式表达,其相对分子质量约为38.9×103.Western blot检测重组蛋白FTZ-F1,采用抗His标签抗体识别FTZ-F1,结果表明为单一条带.纯化后的蛋白浓度为1.25 mg/ml,纯度为90％.结论 成功构建了重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1,鉴定重组蛋白FTZ-F1的表达,为该蛋白生物学功能的研究奠定了基础.