目的 研究Gremlin-2基因rs4454537基因多态性及血清25-羟维生素D3[25(OH)D3]水平异常对绝经后妇女骨质疏松的影响.方法 选取邢台市人民医院2020年2月至2023年10月收治的绝经后骨质疏松患者160例为研究组,并选取同期健康体检的绝经女性160例为对照组,比较两组妇女骨密度及25(OH)D3水平,并分析两者相关性.采用TaqMan探针法检测患者血液中Gremlin-2基因rs4454537位点基因多态性,比较两组基因分布情况、不同基因型患者血清25(OH)D3水平以及骨密度差异,并分析绝经后妇女骨质疏松的影响因素.结果 研究组的25(OH)D3表达水平以及正位骨密度(BMD)、T值均低于对照组(P＜0.05).Pearson 法分析显示 25(OH)D3 表达水平与 BMD 呈正相关性(r=0.638,P＜0.05).Gremlin-2 基因 rs4454537位点存在3种基因型:TT、TC和CC,研究组的T等位基因、TT基因型频率低于对照组(x2=19.643,P＜0.001,x2=18.321,P＜0.001).不同基因型患者骨密度、25(OH)D3水平差异有统计学意义,其中TT型患者的骨密度、25(OH)D3水平明显高于TC、CC基因型患者(均P＜0.05).Logistic回归分析结果显示,Gremlin-2基因rs4454537位点基因型、25(OH)D3水平是绝经后骨质疏松的独立影响因素(P＜0.01).结论 Gremlin-2基因rs4454537位点基因多态性以及血清25(OH)D3水平与绝经后妇女骨质疏松密切相关,其中TT基因型患者血清25(OH)D3水平处于较高水平,可能降低骨质疏松发生风险.

目的:单细胞RNA测序解析普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中CD34 +细胞的类型与功能。 方法:该研究为实验研究。构建CD34 +细胞谱系追踪小鼠，实现CD34 +细胞在荧光条件下可视化。取6只7~8周龄雄性CD34 +细胞谱系追踪小鼠（设为糖尿病组），腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病模型，于小鼠13周龄时在其背部制备全层皮肤缺损创面；另取6只13周龄雄性CD34 +细胞谱系追踪小鼠（设为对照组），在其背部制备全层皮肤缺损创面。伤后4 d，分别收集对照组3只小鼠和糖尿病组2只小鼠创面组织，消化制备单细胞悬液，采用荧光活化细胞分选法筛选出CD34 +细胞后进行单细胞RNA测序，采用R语言的Seurat 4.0.2程序通过降维可视化和细胞聚类分析CD34 +细胞类型并筛选注释各CD34 +细胞亚群的标记基因，对2组小鼠创面组织间CD34 +成纤维细胞（Fb）、平滑肌细胞、角质形成细胞（KC）、类软骨细胞的差异表达基因（DEG）进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析，探索细胞功能。 结果:伤后4 d，2组小鼠创面组织中CD34 +细胞均包含7种细胞类型，具体为内皮细胞、Fb、KC、巨噬细胞、T细胞、平滑肌细胞和类软骨细胞，其中Fb细分为5个亚群。与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中的CD34 +内皮细胞、Fb亚群1、Fb亚群4、KC、类软骨细胞占比升高，CD34 +Fb亚群2、Fb亚群3和平滑肌细胞占比下降。注释CD34 +类软骨细胞、内皮细胞、Fb亚群1、Fb亚群2、Fb亚群3、Fb亚群4、Fb亚群5、KC、巨噬细胞、平滑肌细胞、T细胞的标记基因分别为转移相关肺腺癌转录本1、脂肪酸结合蛋白4、Gremlin 1、补体成分4B、H19印记母源表达转录本、Dickkopf Wnt信号通路抑制剂2、纤维调节蛋白、角蛋白5、CD74分子、G蛋白信号调节蛋白5、可诱导T细胞共刺激分子。KEGG和GO富集分析显示，与对照组比较，糖尿病组小鼠伤后4 d创面组织中CD34 +Fb差异表达显著的DEG显著富集于炎症反应、细胞外基质（ECM）组装、细胞增殖调控、衰老相关条目（ P值均<0.05），CD34 +平滑肌细胞差异表达显著的DEG显著富集于细胞迁移、凋亡过程、转录的正调控、吞噬体等条目（ P值均<0.05），CD34 +KC差异表达显著的DEG显著富集于线粒体功能、转录、神经退行性疾病相关条目（ P值均<0.05），CD34 +类软骨细胞差异表达显著的DEG显著富集于节律调控、ECM、病毒感染等相关条目（ P值均<0.05）。 结论:CD34 +细胞在普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合过程中均存在高异质性，2种小鼠创面间CD34 +细胞亚群差异表达显著的DEG显著富集的相关功能与创面愈合过程紧密相关。

Gremlin基因属于转化生长因子β(TGF-β)超家族,其编码的蛋白质具有高度保守性,是骨形态形成蛋白(BMP)拮抗剂家族成员.Gremlin基因最早从蟾蜍中枢神经脊中克隆出来,其编码的蛋白有三种,分别命名为Gremlin-1、Gremlin-2和Gremlin-3.Gremlin基因在肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、心纤维化、胰腺纤维化、晶状体及视网膜纤维化等疾病的发生、发展中均起重要作用,其机制多与BMP/Smads信号传导通路、TGF-β/Smads信号传导通路有关,主要通过影响Smads蛋白胞内信号通道影响纤维化的发生,与Gremlin-VEGFR2轴、NF-κB信号通路等关系密切.在促纤维化发生过程中,Gremlin可能依赖于应激活化蛋白激酶途径的激活,受miR-27b/30-UTR的正向调节、抗纤维化趋化因子10的负向调节、多糖硫酸乙酰肝素的适当调节;在眼视网膜病变的发生过程中,Gremlin可能受甲状旁腺激素相关蛋白水平的正向调节.

目的·筛选脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,Lpl)基因杂合敲除(Lpl+/-)小鼠和野生型(wild type,WT)小鼠的胰岛组织中差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)和通路,探讨脂毒性介导2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)发病过程中的分子机制.方法· 将Lpl+/-小鼠和WT小鼠的胰岛进行分离纯化.通过基因芯片分析获得DEGs,并对其进行GO(Gene Ontology)功能分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析.采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)对关键基因表达进行验证.结果·共筛选出187个DEGs.GO功能分析和KEGG通路分析显示,DEGs主要富集于免疫细胞增殖分化、炎症信号通路及细胞黏附等生物过程.在Lpl+/-小鼠和WT小鼠的表达差异最为显著的前10个基因中,gremlin 1(Grem1)基因与胰岛β细胞功能密切相关,且经qPCR验证与基因芯片的结果一致.结论·脂毒性介导T2DM的过程涉及多个信号通路的参与,其可能是通过抑制Grem1表达导致胰岛β细胞功能障碍.

目的 研究骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)拮抗剂Gremlin1(GREM1)对根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs)功能的影响,并探索其机制.方法 体外分离培养SCAPs,免疫荧光染色实验检测GREM1在SCAPs的亚细胞定位;利用GREM1shRNA慢病毒转染,敲低GREM1;分别对GREM1敲低组和对照组SCAPs进行成骨诱导,实时荧光定量PCR(Real time-PCR)和Western blot检测转染后GREM1的敲低效果.取两组细胞,成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,成骨/成牙本质诱导3周后进行茜素红染色,并用Real time-PCR检测成骨诱导0周、1周、2周、3周后成骨/成牙相关基因骨钙素(OCN)、骨桥素(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白(DMP1)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)以及成骨/成牙关键转录因子Runt相关转录因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、同源盒基因2(DLX2)的表达.取两组细胞,CCK8和流式细胞术检测细胞增殖能力变化;Real time-PCR检测衰老相关基因p53、细胞周期调控因子1(Waf1)和干性相关基因krupple样因子4(KLF4)、性别决定区Y框蛋白2(SOX2)的表达,以及BMPs相关基因(BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP9)的表达.结果 免疫荧光实验表明GREM1在胞核内表达量比胞浆中更高;Real time-PCR和Western blot验证了GREM1敲低组的敲低效果.GREM1敲低组ALP活性高于对照组(P<0.05),茜素红染色浅于对照组;OCN、DMP1在1周、2周、3周时表达均有升高,OPN在2周时升高,BSP在3周时升高,DSPP在1周时升高,差异有统计学意义(P<0.05),成骨关键转录因子RUNX2、OSX、DLX2均在不同时段升高,差异有统计学意义(P<0.05).CCK-8法和流式细胞术显示GREM1敲低组增殖能力较对照组下降(P<0.05).与对照组相比,GREM1敲低组BMP2、BMP6、BMP7表达升高,SOX2、KLF4表达升高(P<0.05),P53、Waf1表达下降(P<0.05).结论 GREM1敲低后,能促进SCAPs成骨/成牙分化及干性,抑制SCAPs的增殖及衰老;GREM1对SCAPs的功能作用可能是通过在mRNA水平调控BMP2、BMP6、BMP7的表达实现的.

本文总结了目前基因多态性对骨质疏松症的影响.维生素D受体基因突变会改变矿物质的代谢,使骨密度降低;雌激素受体基因同一位点对不同种族、不同性别的影响可能存在差异;Ⅰ型胶原基因可加重心血管疾病患者的骨质疏松症;Gremlin-2基因的不同位点对骨质疏松症的效果可能相反;肿瘤坏死因子-α基因、护骨因子基因的基因-基因联合效应都可能造成骨质疏松症风险增加.以上研究结果均表明基因多态性对骨质疏松症中具有独特作用,并可能提供针对性治疗来避免骨骼退变.

目的 探讨miR-206对鼻咽癌细胞增殖、迁移的影响及其机制.方法 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测鼻咽癌细胞株(NP69、CNE2、HNE1、6-10B及5-8F)中miR-206的表达水平,然后选择miR-206表达水平较低的鼻咽癌细胞株HNE1和CNE2作为实验对象,将每株细胞均分为两组:NC组和miR-206 mimics组,分别转染无意义序列NC和miR-206 mimics.采用MTT法、细胞集落克隆检测细胞的增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力.使用公共数据库GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)分析Gremlin1(GREM1)在人鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达,蛋白质印迹实验(Western blot)检测鼻咽癌细胞中N-catenin、Vimentin及GREM1蛋白表达量,采用qRT-PCR检测鼻咽癌细胞中GREM1 mRNA的表达水平.使用生物信息学网站CoGeMiR、MicroRNAdb预测miR-206可能的靶基因,采用Transwell Boyden小室法检测过表达GREM1对鼻咽癌细胞迁移能力的影响.结果 在鼻咽癌细胞HNE1、CNE2中,miR-206 mimics组细胞存活率、克隆细胞集落数目、细胞迁移数目,N-catenin、Vimentin蛋白的表达均低于NC组(P<0.05).GREM1在人鼻咽癌组织中表达水平高于癌旁组织,miR-206 mimics组的GREM1的mRNA及蛋白表达水平较NC组下调(P<0.05).生物信息学网站CoGeMiR、MicroRNAdb预测miR-206与GREM1 mRNA存在结合位点.过表达GREM1后鼻咽癌HNE1、CNE2细胞的迁移能力增强(P<0.05).结论 miR-206对鼻咽癌细胞株HNE1、CNE2的细胞增殖、迁移和上皮间充质化(EMT)有抑制作用,这可能与其对GREM1表达的调控有关.