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一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统
编辑人员丨2024/3/30
在 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑中,借助于双链 DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用.为提高CRISPR/Cas9 系统介导 dsDNA 供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因 LacI 分别与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的 SpCas9 和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统(donor adapting system,DAS).首先在报告载体水平上对Cas9 核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复(homology-directed repair,HDR)效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用 CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达 30.5%,显著高于野生型.综上所述,本研究开发了新型的 CRISPR/Cas9-hLacI 供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9 基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具.
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编辑人员丨2024/3/30
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大肠杆菌染色体上严谨型启动子的构建
编辑人员丨2023/8/6
[背景]启动子的渗漏表达是代谢工程和合成生物学较为关注的问题,探索严谨型启动子使之能像开关一样控制基因的表达有助于解决这一问题.[目的]为避免在质粒上研究启动子带来的弊端,本研究将在染色体上对严谨型启动子进行构建和评价.[方法]基于4种调控元件四环素tetO、乳糖lacO、阿拉伯糖araC和鼠李糖rhaR的序列,以及2种来源的启动子PL和Plac 序列,设计和组合构建了6个启动子PtetO2、PtetO3、PlacO2、PlacO3、PlacO+ara和PlacO+rha.应用CRISPR/Cas9系统将这6个启动子序列整合到大肠杆菌ATCC 8739染色体上,利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的表达,分析这6个启动子的相对表达强度和严谨型控制情况.[结果]GFP表达分析显示,启动子PlacO+rha为最佳严谨型启动子,在无诱导剂时表达为0.02,有诱导剂时最大表达强度为lacZ基因启动子的12倍,相对控制范围为600倍.[结论]研究结果将为代谢工程和合成生物学中的精确调控基因表达奠定良好的应用基础.
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编辑人员丨2023/8/6
