目的:通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)，并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法:针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA)，将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞，利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2 －/－ Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2 －/－ Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用 t检验。 结果:利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株，HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达，HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较，差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15， t＝0.17， P>0.05)，但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%， t＝5.62， P<0.01]；KP感染HMGB2 －/－ Raw264.7，促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml， t＝5.00， P<0.01；(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml， t＝3.36， P<0.01；(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml， t＝3.68， P<0.05]。 结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株，验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

目的:构建并鉴定气道上皮细胞条件性Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）基因敲除小鼠，观察慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）患者气道上皮SHP-1表达情况及SHP-1表达缺陷对肺气肿小鼠表型的影响。方法:检测慢阻肺患者肺组织中气道上皮SHP-1的表达情况。采用CRISPR/Cas9技术构建SHP-1 flox/flox转基因小鼠，并将其与气道上皮细胞Clara蛋白10-环化重组酶与雌激素受体融合转基因小鼠（CC10-CreER +/+）进行交配，腹腔注射他莫昔芬后，获得气道上皮SHP-1基因敲除小鼠（SHP-1 flox/floxCC10-CreER +/-，SHP-1 Δ/Δ）。提取小鼠鼠尾和肺组织DNA，经PCR扩增后判别小鼠的基因型；通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光等方法验证气道上皮细胞SHP-1基因的敲除效果。使用弹性蛋白酶构建肺气肿小鼠模型，评估各组小鼠肺气肿严重程度。 结果:慢阻肺患者气道上皮SHP-1表达显著下调。基因型鉴定证实SHP-1 Δ/Δ小鼠表达CC10-CreER及SHP-1-flox。他莫昔芬诱导后，我们从DNA、RNA及蛋白水平证明SHP-1 Δ/Δ小鼠气道上皮细胞中SHP-1蛋白表达缺失，表明气道上皮细胞特异性SHP-1基因敲除小鼠构建成功。肺气肿动物模型中，SHP-1 Δ/Δ小鼠与对照组相比，肺气肿表型更为严重，表现为肺组织肺泡结构紊乱，肺泡壁破裂融合形成肺大疱。 结论:本研究成功建立并鉴定气道上皮细胞SHP-1基因敲除小鼠模型，为深入阐明SHP-1在慢阻肺进程中的作用及其机制提供了新的实验工具。

目的:探究 Klhl24基因起始密码子突变小鼠毛囊异常的生理表型，为阐明 Klhl24调控毛囊发育的机制提供基础。 方法:将通过CRISPER/Cas9技术构建的 Klhl24基因起始密码子突变 Klhl24 c.3G>T杂合（ Klhl24 c.3G/T）雄性小鼠与野生型雌性小鼠杂交，对同窝小鼠进行基因型鉴定， Klhl24 c.3G/T 雄性小鼠和野生型（WT）雄性小鼠分别作为实验组与对照组，每组小鼠≥ 3只。在小鼠出生后第21天（第1个毛发静止期）及45天（第2个毛发静止期）进行胶带贴毛实验，对小鼠背部皮肤组织进行Ki67免疫组化检测，并用扫描电镜、透射电镜观察，用脱氧核糖核苷酸介导的dUTP末端标记（TUNEL）试剂盒检测毛囊内凋亡细胞。实验组与对照组检测结果比较采用Dunnett- t检验。 结果:第1个静止期与第2个静止期 Klhl24 c.3G/T小鼠每0.25 cm 2胶带脱落毛干数量分别为1 224 ± 51.08与1 514 ± 72.15，WT小鼠分别为320 ± 55.68和125 ± 2.86，第1、2个静止期 Klhl24 c.3G/T小鼠脱落毛干数量均明显多于WT小鼠（ t = 11.96、19.24，均 P < 0.001）。对第1个静止期脱落毛干进行扫描电镜观测，显示脱落毛干底部呈杵状。出生后第59天时，WT小鼠背部无新毛干长出，毛囊处于静止期，而 Klhl24 c.3G/T小鼠背部已有新毛干长出，毛囊进入下一个生长期。透射电镜观察显示，在第1个毛囊静止期（P21） Klhl24 c.3G/T 小鼠背部皮肤毛囊细胞中线粒体内嵴结构混乱，单个毛囊结构中凋亡细胞数量为12 ± 1.15，高于WT小鼠（3 ± 0.63， n = 8， t = 6.874， P < 0.001）。 结论:Klhl24 c.3G/T小鼠毛发异常表型主要为毛囊静止期锚定毛干能力降低，毛囊生长期提前，毛囊细胞中线粒体结构异常，并且凋亡细胞数量增加。

目的:本研究旨在探讨蛋白酶体26S亚基非ATP酶7(PSMD7)表达对肾透明细胞癌增殖和迁移能力的影响。方法:利用临床生信之家数据库分析PSMD7在肾透明细胞癌中的差异表达。在人肾透明细胞癌皮肤转移细胞(Caki-1)细胞株中利用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9技术导入短发夹RNA(shRNA)敲低PSMD7，设置组别为Caki-1对照组细胞株，稳定敲低PSMD7实验组的Caki-1细胞株(shPSMD7-1、shPSMD7-2)，以蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Caki-1细胞中PSMD7的敲低效率。通过细胞计数盒(CCK-8)增殖实验、平板克隆实验和Transwell实验评估实验组和对照组细胞增殖和迁移的能力。两组间比较采用独立样本 t检验。 结果:PSMD7在多种肿瘤中表达显著上调，其中包括肾透明细胞癌，肿瘤组织中PSMD7表达高于正常组织[5.70(4.13～7.29)比3.46(1.74～5.17)， P<0.05]。通过蛋白质免疫检测法检测敲低效率(1.36±0.05比0.43±0.07， t＝10.77， P<0.05；1.36±0.05比0.31±0.07， t＝12.53， P<0.05)；CCK-8结果显示，敲低PSMD7后，细胞增殖能力显著下降(1.32±0.91比0.67±0.49， t＝3.448， P<0.05；1.32±0.91比0.60±0.35， t＝3.222， P<0.05)。平板克隆形成实验显示，PSMD7敲低组细胞的增殖水平明显低于对照组[(792.0±24.0)个比(520.0±28.0)个， t＝7.376， P<0.05；(792.0±24.0)个比(518.0±30.0)个， t＝7.132， P< 0.05]。Transwell实验显示，PSMD7敲低组细胞的迁移能力明显低于对照组[(690.0±14.0)个比(237.5±33.5)个， t＝12.46， P< 0.05；(690.0±14.0)个比(176.5±13.5)个， t＝26.40， P< 0.05]。 结论:在肾癌组织中，PSMD7表达上调；敲低PSMD7表达可有效抑制肾癌细胞的增殖和迁移能力。

宫颈癌是世界上女性癌症排名第4位的恶性肿瘤，严重威胁女性的健康。宫颈癌患者的主要治疗方案为手术或同步放化疗，随着医学研究的发展，研究者们致力于探究更为有效、特异的治疗方案，以期增加宫颈癌的治疗策略和提高治疗效果。簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）技术是Cas9蛋白利用向导RNA（gRNA）的引导进而靶向目标基因，实现对目标基因精准编辑的方法。目前，CRISPR/Cas9技术已成为一种很有前途的强大基因编辑工具，是一种新的有效的靶向治疗方法，且被应用于多种肿瘤的治疗中。主要从作用靶点、联合治疗策略以及相关耐药基因筛选等方面对CRISPR/Cas9技术在宫颈癌治疗中的研究进展进行综述，以期为宫颈癌的治疗提供新的策略。

目的:研究人肝癌组织中S期激酶相关蛋白2（SKP2）表达与预后的关系以及肝癌细胞中SKP2表达对人肝癌细胞放射敏感性的影响。方法:使用TCGA数据库中肝癌组织和正常对照组织的测序结果，分析 SKP2基因在肝癌组织中的表达情况及其与患者预后的关系。使用Western blot检测肝癌细胞放射照射前后SKP2蛋白水平表达变化。利用CRISPR/Cas9技术敲除肝癌细胞 SKP2基因的启动子和第1外显子，建立 SKP2基因敲除的PLC/PRF/5和Hep3B肝癌细胞系模型，并进一步进行放射照射。用克隆形成实验检测 SKP2基因敲除细胞的放射敏感性变化情况。 结果:对TCGA数据库分析结果显示，与正常组织比较， SKP2基因在肝癌组织中表达升高。对 SKP2高、低水平肝癌患者总体生存率进行K-M法分析，结果显示 SKP2高表达肝癌患者预后相对较差，其5年生存率为34.6%， SKP2低表达肝癌患者则为50.6%（ HR=2.18，95% CI为1.46~3.27， P<0.001）。体外细胞实验显示肝癌细胞受到放射照射后SKP2表达水平明显升高。在CRISPR/Cas9敲除SKP2 -/-肝癌细胞中，克隆形成实验结果显示SKP2 -/-肝癌细胞的放射敏感性较SKP2 +/+明显增加。 结论:SKP2基因在肝癌组织中表达升高，且高表达者较低表达者预后差。放射可上调PLC肝癌细胞SKP2的表达水平，而敲除 SKP2后其放射敏感性明显增加。

目的:应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法:选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型，设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3，制备AAV，病毒滴度达1～4×10 13 GC/ml；感染WD肝细胞，72 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出其中活性最高者sgRNA1，构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT，应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞，测序和T7E1酶切检测模板修复效率；用HT特异性引物行PCR，验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。 结果:Sanger测序结果显示，sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%]，与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%]，差异有统计学意义( P<0.05)。进一步用HT进行基因修正，能检出特异性修正后的ATP7B基因；二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。 结论:AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。

作为新一代的基因编辑技术，规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins，CRISPR/Cas)系统具有强大的基因编辑功能，已被应用于许多领域。目前，已开发的规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein, Cas)9、Cas12、Cas13和Cas14检测系统被广泛应用于传染病病原体的核酸检测，具有检测成本低、操作简单、灵敏度高等优点。本研究介绍了CRISPR/Cas系统的发展史、作用机制，以及几种Cas蛋白在传染病相关病原核酸检测中的应用。

目的:探究免疫球蛋白样结构域受体2（immunoglobulin-like domain-containing receptor 2，Ildr2）在缺血再灌注诱导肾纤维化中的作用。方法:利用CRISPR/Cas9技术构建 Ildr2敲除小鼠（KO组），其对照组为野生型小鼠（WT组）。通过夹闭左侧肾蒂构建单侧肾脏缺血再灌注（unilateral renal ischemia reperfusion，UIR）模型（UIR组），造模后分为KO-UIR组和WT-UIR组；假手术小鼠（Sham组）不进行缺血处理。采用肌氨酸氧化酶法检测血清肌酐水平；二乙酰肟比色法检测血尿素氮水平；酶联免疫吸附测定法检测尿白蛋白水平，计算尿白蛋白/肌酐比值；HE、PAS及MASSON染色检测肾组织炎性细胞浸润情况和纤维化程度；实时荧光定量PCR检测 Ildr2，肾损伤相关分子中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）和肾损伤分子1（kidney injury molecule-1， KIM-1），纤维化标志分子Ⅰ型胶原α1（type 1 collagen α-1， Col1α1）、纤维连接蛋白1（fibronectin， Fn1）、α平滑肌肌动蛋白（ α-smooth muscle actin， α-SMA）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor， CTGF），以及炎症相关分子巨噬细胞标志物 F4/80、单核细胞趋化因子1（monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1）的mRNA表达水平。免疫荧光和Western印迹法检测Ildr2、Col1α1及α-SMA的蛋白表达水平。 结果:（1）实时荧光定量PCR和Western印迹结果显示UIR组Ildr2 mRNA和蛋白表达水平均显著低于Sham组（均 P<0.05）。（2）KO组和WT组小鼠体重、血清肌酐、血尿素氮、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及三酰甘油等的差异均无统计学意义（均 P>0.05）。实时荧光定量PCR结果显示，KO组和WT组 NGAL、 KIM-1、 α-SMA、 Col1α1、 CTGF、 Fn1、 MCP-1及 F4/80 mRNA表达水平的差异均无统计学意义（均 P>0.05）。组织学染色结果显示KO组和WT组均无炎性细胞浸润异常及间质纤维化。（3）与WT-UIR组相比，KO-UIR组血清肌酐和血尿素氮水平均较高（均 P<0.05）。实时荧光定量PCR结果显示，KO-UIR组 NGAL、 F4/80、 MCP- 1、 Col1α1、 α- SMA和 CTGF mRNA表达水平均显著高于WT-UIR组（均 P<0.05）。免疫荧光和Western印迹结果显示，KO-UIR组Col1α1和α-SMA蛋白表达水平均明显高于WT-UIR组（均 P<0.05）。组织学染色结果显示，相比WT-UIR组，KO-UIR组小鼠炎性细胞浸润明显较多，间质胶原纤维沉积和小管损伤较重。 结论:正常生理状态下 Ildr2敲除未引起小鼠表型变化。Ildr2在UIR损伤中起到调控作用， Ildr2缺失导致UIR诱导的肾纤维化程度加重。

目的:探讨约瑟芬结构域含蛋白2（JOSD2）的表达对肾透明细胞癌增殖与迁移的影响。方法:在Timer、UALCAN，数据库中分析JOSD2在肾癌中的差异表达和预后（ P<0.05）。在Caki-1细胞系中使用成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9技术导入shRNA敲低JOSD2。设置对照组和稳定JOSD2敲低组（sh1、sh2），通过细胞计数试剂盒（CCK-8）增殖实验、平板克隆实验、Transwell实验分别观察对细胞增殖、迁移能力的影响。采用独立样本 t检验进行组间比较。 结果:生信数据库发现JOSD2在多种肿瘤中异常高表达，其中包括肾透明细胞癌[28.707（22.825～36.424）比20.433（17.507～23.548）， P<0.05]。在敲低JOSD2后，CCK-8结果显示，JOSD2敲低后细胞增殖能力明显低于对照组（3.11±0.08比2.12±0.13， t＝14.64， P<0.05；3.10±0.08比2.18±0.20， t＝10.26， P<0.05）。平板克隆形成实验结果显示，JOSD2敲低后细胞集落形成能力显著低于对照组[（365.0±34.6）个比（217.0±22.0）个， t＝6.948 P<0.05；（365.0±34.6）个比（186.0±38.2）个， t＝7.216， P<0.05]。Transwell实验显示，JOSD2敲低后细胞迁移能力显著低于对照组[（1 234.5±85.1）个比（689.8±58.7）个， t＝10.540， P<0.05；（1 234.5±85.1）个比（635.0±112.3）个， t＝6.967， P<0.05]。 结论:JOSD2在肾癌中表达上调，敲低JOSD2能抑制肾癌细胞增殖和迁移。