目的:探讨线粒体自噬对脂多糖(LPS)诱导的髓核(NP)细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法:以大鼠椎间盘NP细胞为研究对象，首先以LPS(200 μg/ml)分别干预髓核细胞0、24、48 h，通过蛋白质印迹法(Western blot)检测LPS对NLRP3炎症小体活化和线粒体自噬的影响；通过免疫荧光观察LPS对线粒体自噬水平的影响；组间比较采用单因素方差分析。进一步利用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1阻断线粒体自噬，实验分组为对照组(con)、LPS(24 h)+Mdivi-1、LPS(24 h)。通过Western blot检测Mdivi-1对LPS诱导的NLRP3炎症小体活化的影响；通过免疫荧光评估各实验组Mito Tracker Red探针标记的线粒体与LC3B及NLRP3的细胞内共定位；通过免疫荧光评估各实验组Mito Tracker Red探针标记的线粒体与LC3B的细胞内共定位；通过免疫荧光检测分析Mdivi-1对LPS诱导的NP细胞线粒体膜电位(ΔΨm)及线粒体ROS的影响；组间比较采用 t检验。 结果:与对照组比较，随着LPS干预时间延长(24、48 h)，NLRP3( F＝175.147， P<0.01)、GSDMD ( F＝398.479， P<0.01)、裂解的GSDMD(cleaved-GSDMD， F＝327.951， P<0.01)和白细胞介素(IL)-1β ( F＝228.902， P<0.01)的蛋白表达逐渐上调；与对照组比较，在LPS(24 h)组p62蛋白表达明显降低( t＝14.336， P<0.01)而LC3B Ⅱ蛋白表达明显升高( t＝10.909， P<0.01)；对比分析LPS(24 h)组和LPS(48 h)组发现，LPS(48 h)组p62蛋白表达明显升高( t＝－13.972， P<0.01)而LC3B Ⅱ蛋白表达明显降低( t＝6.247， P<0.05)；免疫荧光观察线粒体和LC3B共定位显示，与对照组比较，在LPS干预24 h后线粒体自噬增强( t＝－11.408， P<0.01)，而在LPS干预48 h后线粒体自噬逐渐减弱( t＝9.869， P<0.05)；利用Mdivi-1阻断线粒体自噬后显示，与LPS(24 h)组比较，在Mdivi-1预处理组NLRP3 ( t＝－7.551， P<0.05)、GSDMD( t＝－7.089， P<0.05)、cleaved-GSDMD( t＝－4.396， P<0.05)和IL-1β ( t＝－10.451， P<0.01)的表达明显升高，ΔΨm丢失更加严重( t＝－6.213， P<0.05)，线粒体ROS产生增加( t＝－6.496， P<0.05)。 结论:阻断线粒体自噬进一步活化了LPS诱导的NLRP3炎症小体，表明线粒体自噬在LPS诱导NP细胞死亡中具有保护作用。

目的:分析抑制动态相关蛋白1（dynamin related protein 1，Drp1）介导的线粒体过度分裂对脓毒症心肌细胞和线粒体功能的影响，探讨维持线粒体动力学平衡在脓毒症心肌病（sepsis induced cardiomyopathy，SIC）发病过程中的保护作用。方法:培养大鼠H9C2心肌细胞，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激细胞建立SIC细胞模型，LPS刺激30 min前予线粒体分裂抑制剂（mitochondrial division inhibitor 1，Mdivi-1）干预，分为对照组（Control）、LPS刺激组（LPS）、Mdivi-1对照组（Mdivi-1）和LPS+Mdivi-1干预组（LPS+Mdivi-1）。CCK-8检测细胞存活率，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测细胞损伤情况，MitoTracker探针染色激光共聚焦观察线粒体形态，JC-1探针染色检测线粒体膜电位水平，DCFH-DA探针检测细胞总活性氧（ROS）水平，Annexin V-FITC/PI探针流式细胞仪检测细胞凋亡情况，实时荧光定量PCR、Western blot检测Drp1、视神经萎缩蛋白1(optic Atrophy 1，Opa1)、线粒体融合蛋白2 (mitofusin 2，Mfn2)表达水平。组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:与Control组相比，LPS刺激组细胞存活率明显降低，LDH活性升高，线粒体平均长度减小，线粒体膜电位下降、细胞ROS生成增多，细胞凋亡增加（均 P<0.05）；予以Mdivi-1干预后，与LPS刺激组相比，细胞存活率升高，心肌细胞损伤减轻，线粒体平均长度延长，线粒体功能障碍减轻，细胞凋亡受到抑制（均 P<0.05）。 结论:Mdivi-1可能通过抑制Drp1介导的线粒体分裂维持线粒体动力学平衡，减轻线粒体功能障碍，从而保护LPS诱导的心肌细胞损伤。

目的 研究 Delta/Notch 样表皮生长因子相关受体(delta/notch-like epidermal growth factor-related receptor,DNER)在胃癌中的作用及其调节机制.方法 通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测胃癌组织和细胞中DNER mRNA和蛋白表达水平.构建沉默DNER表达的胃癌细胞系SGC7901,用线粒体动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,DRP1)抑制剂Mdivi-1处理细胞.CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞活力、侵袭能力和细胞凋亡.Western blot检测DNER蛋白、凋亡相关蛋白[半胱天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-3)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)]、自噬相关蛋白[微管相关蛋白 1 轻链 3-Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/Ⅰ,LC3 Ⅱ/Ⅰ)、p62,PTEN 诱导激酶 1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和Parkin],以及线粒体裂变和融合蛋白[DRP1,线粒体分裂因子(mitochondrial fission factor,MFF)、线粒体分裂蛋白 1(fission mitochondrial 1,FIS1)、视神经萎缩蛋白 1(optic atrophy 1,OPA1)、线粒体融合蛋白1(mitofusin 1,MFN1)和MFN2]水平.结果 胃癌肿瘤组织和细胞中DNER mRNA,蛋白表达水平分别显著高于相邻正常组织(t=-52.485,-46.955)和人正常胃上皮细胞(F=60.551,60.652),差异具有统计学意义(均P＜0.001).沉默DNER显著抑制SGC7901细胞的增殖和侵袭、诱导细胞凋亡、增加细胞凋亡相关蛋白表达,差异具有统计学意义(t=8.026～25.903,均P＜0.05).沉默DNER显著升高LC3 Ⅱ/Ⅰ比率(t=18.086),降低p62蛋白水平(t=6.747),促进PINK1和Parkin蛋白在线粒体的聚集(t=15.630,18.171),抑制线粒体融合蛋白OPA1,MFN 1和MFN2表达(t=12.835,8.963,9.732),促进线粒体裂变蛋白DRP1,MFF和FIS1表达(t=16.034,16.939,15.971),差异具有统计学意义(均P＜0.05).Mdivi-1处理可抵消沉默DNER对胃癌细胞线粒体自噬及细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.结论 DNER通过抑制线粒体动力学失衡减少线粒体自噬,促进细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,从而促进胃癌进展.

目的 探讨线粒体动力相关蛋白(DRP1)对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞上皮-间充质转化(EMT)进程的影响.方法 构建H2O2干预ARPE-19细胞模型,将ARPE-19细胞分为3组,NG组:采用含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞6 h;H2O2组:先采用650 μmol·L-1 H2O2干预细胞,此后培养方式及时间与NG组相同;H2O2+Mdivi-1 组:先采用 10 μmol·L-1 Mdivi-1 处理 ARPE-19 细胞 2 h,再给予 650μmol·L-1 H2O2干预,此后培养方式及时间与NG组相同.Western blot检测各组细胞p-DRP-1/DRP1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波型蛋白(Vimintin)及紧密连接蛋白(ZO-1)表达水平;线粒体红色荧光探针检测各组细胞线粒体形态;线粒体超氧化物红色荧光探针检测各组细胞线粒体活性氧(ROS)水平;JC-1染色试剂盒检测各组细胞线粒体膜电位;免疫荧光检测各组细胞中ZO-1表达水平.结果 H2O2组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值高于NG组,H2O2+Mdivi-1组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值低于H2O2组,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).H2O2+Mdivi-1组细胞较H2O2组线粒体碎片化程度得到改善.H2O2组细胞线粒体ROS水平(4.42±0.29)与NG组(1.00±0.17)及H2O2+Mdivi-1组(2.15±0.18)比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).H2O2组细胞红/绿荧光强度比值(0.16±0.12)与NG组(1.00±0.09)及H2O2+Mdivi-1组(0.42±0.05)比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).H2O2组细胞上皮样标志物表达下降,间质样标志物表达上升,H2O2+Mdivi-1组细胞上皮样标志物表达上升,间质样标志物表达下降.各组细胞α-SMA、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、Vimintin及ZO-1相对表达量比较,H2O2组与NG组及H2O2+Mdivi-1组比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).ZO-1免疫荧光染色实验显示,H2O2+Mdivi-1组的细胞连接紧密程度优于H2O2组.结论 DRP1可调控线粒体动态平衡,靶向DRP1可改善线粒体功能并抑制EMT进展,从而减轻H2O2诱导的RPE细胞功能障碍.

目的:研究线粒体分裂抑制剂1(Mdivi-1)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠髓鞘保护中的作用,探讨Mdivi-1抑制髓鞘变性的机制.方法:小鼠经髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白第35～55位肽段(MOG35-55)免疫后,随机分为DMSO模型组和Mdivi-1干预组.于免疫后第28天处死小鼠,行Luxol fast blue染色分析髓鞘丢失情况,免疫荧光染色和TUNEL染色小鼠脊髓组织和体外细胞实验分析Mdivi-1髓鞘保护机制.结果:与DMSO模型组比较,Mdivi-1处理明显减少EAE小鼠脊髓组织白质区髓鞘丢失,减少少突胶质细胞凋亡及线粒体凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、caspase-9、cytochrome C和Bax的表达;体外MO3.13少突胶质细胞培养实验发现,Mdivi-1可以明显阻止星形孢菌素(staurosporine)处理诱导的线粒体膜电位去极化,减轻细胞损伤,增强细胞活力.结论:Mdivi-1可能通过抑制少突胶质细胞线粒体相关凋亡信号通路发挥髓鞘保护作用.

目的 拟探讨线粒体分裂抑制剂Mdivi-1对脓毒症大鼠肠道屏障功能的保护作用.方法 采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)复制大鼠脓毒症模型,根据脓毒症救治指南采用乳酸林格氏液(35 mL/kg)进行常规复苏,输液速度3 mL/h.同时在常规复苏的基础上静脉予以1 mg/kg Mdivi-1进行治疗.复苏结束后2 h观察各组大鼠肠道屏障功能、肠道中闭锁小带蛋白(zonula occludes-1,ZO-1)的表达、小肠病理变化、血清炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和白介素1-β(Interleukin-1β,IL-1β)的浓度、平均动脉血压(mean arterial blood pressure,MAP)和生存时间及72 h存活率.结果 与假手术组相比,脓毒症大鼠肠通透性明显增加,D-乳酸明显升高,血清中炎性因子TNF-α和IL-1β浓度显著增高(P<0.05);病理结果显示肠绒毛断裂,腺体萎缩,炎性细胞显著增多.常规复苏治疗后,与脓毒症组相比,血清中TNF-α和IL-1β浓度、肠通透性、D-乳酸浓度轻微降低,肠绒毛紊乱轻微改善,提示常规复苏治疗后对脓毒症的保护作用是有限的.与常规治疗组相比,常规治疗联合线粒体分裂抑制剂Mdivi-1治疗后大鼠血清中TNF-α和IL-1β浓度、肠通透性、D-乳酸浓度显著降低(P<0.05),病理结果显示肠绒毛结构清晰,炎性细胞浸润明显改善.肠组织免疫荧光结果显示,与假手术组相比,脓毒症后紧密连接发生断裂,Mdivi-1治疗后较脓毒症组紧密连接断裂发生明显好转.细胞水平上,LPS刺激后肠上皮细胞间ZO-1表达量显著降低(P<0.05),Mdivi-1治疗后可逆转LPS导致的ZO-1表达量的降低(P<0.05).结论 Mdivi-1对脓毒症大鼠的肠道屏障功能具有保护作用,其机制可能是通过调节ZO-1的表达.

目的 探讨动力蛋白相关蛋白1(Drp1)抑制剂对肠黏膜上皮细胞缺血再灌注损伤的干预作用并分析其机制.方法 将人大肠黏膜上皮细胞系Caco-2分为对照组、模型组、Drp1抑制剂组,对照组正常培养细胞,模型组、Drp1抑制剂组均采用缺氧12 h后复氧2 h的方法构建缺氧复氧模型,Drp1抑制剂组在H/R前给予Drp1抑制剂Mdivi-1干预.采用CCK-8法检测细胞活力,线粒体超氧化物指示剂检测线粒体活性氧(ROS)含量,JC-1法检测线粒体膜电位,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting法检测细胞Drp1、线粒体融合蛋白2(Mfn2)蛋白.结果 细胞活力对照组>Drp1抑制剂组>模型组(P均<0.05);细胞内线粒体ROS含量模型组>Drp1抑制剂组>对照组,线粒体膜电位对照组>Drp1抑制剂组>模型组(P均<0.05);细胞凋亡率模型组>Drp1抑制剂组>对照组(P均<0.05);细胞Drp1蛋白表达模型组>Drp1抑制剂组>对照组,Mfn2蛋白表达对照组>Drp1抑制剂组>模型组(P均<0.05).结论 Drp1抑制剂可减轻肠黏膜上皮细胞缺血再灌注损伤,其机制可能与改善线粒体功能障碍、减少细胞凋亡有关.

目的:探讨发动蛋白相关蛋白1(DRP1)通过调节线粒体动力学对破骨细胞分化的影响。方法:体外培养稳定生长的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)。将细胞分为正常组、模型组[核因子受体配体激活因子(RANKL)]、实验组[RANKL ＋线粒体分裂抑制剂1(Mdivi-1)]。使用细胞毒性实验对不同浓度的DRP1抑制剂(Mdivi-1)作用于RAW264.7细胞的结果进行分析，得出安全有效浓度。通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、肌动蛋白环染色和Western Blot实验，观察DRP1对体外破骨细胞分化过程的调控关系。通过透射电镜、流式细胞术和线粒体膜电位荧光探针(JC-1)检测DRP1在破骨细胞分化过程中对线粒体形态、动力学改变的重要作用。TRAP阳性细胞数、肌动蛋白环面积值、JC-1荧光强度及Western Blot结构数据均采用方差分析。结果:细胞计数试剂盒(CCK-8)结果显示10 μmol/L及以下浓度的Mdivi-1对RAW264.7细胞无明显毒性作用(F＝319，P<0.001)，所以选取10 μmol/L浓度的Mdivi-1干预RAW264.7破骨分化进程。在TRAP染色中发现10 μmol/L的Mdivi-1会明显抑制破骨细胞分化，且TRAP阳性细胞数目及破骨细胞的面积明显减少(F＝391.7，P<0.0001)。肌动蛋白环染色结果表明，与模型组比，RANKL＋Mdivi-1组的破骨细胞数量及肌动蛋白环的面积明显变小(F＝321.5、1444，均为P<0.001)。扫描透射电镜观察，与对照相比，RANKL＋ Mdivi-1组线粒体分裂明显减少。通过Western Blot实验，10 μmol/L浓度的Mdivi-1会明显抑制线粒体动力学相关蛋白及破骨细胞分化相关蛋白的表达，包括DRP1、T细胞核因子c1(NFATc1)、组织蛋白酶K(CTSK)(F＝317.8、3510、6404，均为P<0.001)。JC-1荧光实验结果发现，与模型组相比，异常的线粒体膜电位表达有所恢复(F＝2917, P<0.001)。结论:线粒体分裂蛋白DRP1通过影响破骨细胞表面肌动蛋白环的形成参与调节破骨分化；DRP1通过改变线粒体形态和线粒体动力学参与调节破骨分化。

目的 探讨柚皮苷(Nar)对棕榈酸(PA)处理后成熟脂肪细胞炎症反应的影响及机制.方法 3T3-L1 前脂肪细胞经成脂化诱导为成熟脂肪细胞后采用不同浓度(0、25、50、100、200 μmol·L-1)PA处理细胞 48 h,CCK-8 检测细胞活力,ELISA检测细胞上清 IL-6 水平,确定后续实验最佳 PA 浓度.不同浓度(0、12.5、25、50、100 μmol·L-1)Nar处理成熟脂肪细胞,CCK-8 检测细胞活力,确定后续实验最佳 Nar 浓度.单独 PA 处理实验分为 2 组:Ctrl组、PA组;联合 Nar 处理实验分为 4 组:Ctrl 组、PA 组、Nar 组、PA+Nar 组;western blotting 法检测各组p-ERK1/2和DRP1 蛋白表达水平.联合线粒体裂变抑制剂 Mdivi-1 处理实验分为 7 组:Ctrl 组、PA 组、Nar 组、Mdivi-1 组、PA+Nar组、PA+Mdivi-1 组、PA+Nar+Mdivi-1 组,ELISA和 western blotting 法分别检测 7 组细胞上清IL-6 水平和p-ERK1/2、DRP1 蛋白表达水平.结果 后续实验PA和Nar分别选择 50 和 25 μmol·L-1.与Ctrl组比较,PA组 p-ERK1/2 和DRP1 表达水平均升高(P＜0.001).与 PA 组比较,PA+Nar 组、PA+Mdivi-1组、PA+Nar+Mdivi-1 组 IL-6 水平、p-ERK1/2 和DRP1 表达均更低(P＜0.05);与 PA+Nar 组比较,PA+Nar+Mdivi-1 组IL-6 水平差异无统计学意义(P＞0.05),但p-ERK1/2 和DRP1 表达水平均降低(P＜0.05).结论 Nar可减轻PA处理后成熟脂肪细胞的炎症反应,其机制是通过抑制 ERK1/2 激活和DRP1 表达实现的.

目的:探讨线粒体动力相关蛋白1(Drp1)在小鼠脑出血(ICH)后继发性炎症损伤中的作用及机制.方法:Western blot检测小鼠脑出血后Drp1和磷酸化Drp1(p-Drp1)的表达时间窗,并筛选出选择性Drp1抑制剂(Mdivi-1)在小鼠ICH模型中的最适药物浓度.将小鼠随机分为sham组、ICH组、ICH+溶剂对照组(ICH+Vehicle组)、ICH+Mdivi-1组.采用mNSS评估小鼠神经功能,干湿重法检测脑组织含水量,HE、Nissl染色观察小鼠脑组织形态学改变,MPO染色观察中性粒细胞浸润情况,Western blot检测炎症因子IL-6、TNF-α以及线粒体膜标志蛋白TOM20、COX4Ⅰ1蛋白表达水平.结果:与sham组相比,p-Drp1表达在ICH后12 h显著升高(P<0.01).与ICH+Vehicle组相比,ICH+Mdivi-1组神经功能缺损评分升高(P<0.01),脑组织含水量增多(P<0.05),脑组织损伤程度加重,血肿周围炎症因子IL-6、TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.05),MPO阳性细胞数量明显增加,线粒体膜蛋白TOM20、COX4Ⅰ1的表达显著升高(P<0.01).结论:抑制Drp1可抑制线粒体分裂并加重小鼠ICH后炎症损伤,Drp1可能减轻ICH后炎症反应.