目的:探讨选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398联合光动力疗法(PDT)对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响及其作用机制。方法:将QBC939进行体外培养，人胆管癌QBC939细胞来源于上海中科院细胞库，采用随机化分组法进行分组，培养72 h后进行细胞计数盒-8(CCK-8)实验。实验分为4组，即单纯NS-398组、单纯PDT组、联合实验组和空白对照组，分别将0、25、50、100、200 μmol/L浓度的NS-398和0、2、4、6、8、10 mg/L浓度的血卟啉衍生物(HPD)在0、5、10、15 J/cm 2的光照强度作用下，分别依次联合作用于QBC939细胞；运用CCK-8法检测各组的细胞生长抑制率(R)；采用流式细胞法检测QBC939细胞的凋亡率(A)；应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测QBC939细胞中COX-2和血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的基因表达情况；采用免疫细胞化学链霉亲和素-过氧化物酶结合物(SP)法测定QBC939细胞质中COX-2和VEGF-C的蛋白表达情况；应用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定QBC939细胞上清中COX-2和VEGF-C的蛋白分泌情况，组间比较进行单因素方差分析。 结果:NS-398和PDT两种措施在体外均能单独抑制QBC939细胞生长，当NS-398浓度为50 μmol/L，HPD浓度为8 mg/L、光照强度为5 J/cm 2联合作用后，R可达95%，联合实验组与单纯NS-398组、单纯PDT组和空白对照组比较差异均有统计学意义，继续上调两者的强度，R变化不明显；流式细胞实验中联合实验组A为(55.19±1.14)%，与空白对照组(5.57±1.21)%、单纯NS-398组(19.55±1.06)%和单纯PDT组(18.62±1.18)%比较差异均有统计学意义( F＝6 153.000， P<0.05)；荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)结果可见COX-2在联合实验组(0.21±0.02)中表达量明显低于空白对照组(1.00±0.00)、单纯NS-398组(0.32±0.03)和单纯PDT组(0.35±0.02)，差异均有统计学意义( F＝8 446.182， P<0.05)，VEGF-C在联合实验组(0.23±0.01)中表达量明显低于空白对照组(1.00±0.00)、单纯NS-398组(0.36±0.02)和单纯PDT组(0.38±0.03)，差异均有统计学意义( F＝8 571.895， P<0.05)；SP免疫细胞化学结果表明COX-2在联合实验组[(4.96±0.42)%中]表达量明显低于空白对照组[(55.12±0.87)%]、单纯NS-398组[(21.26±0.49)%]和单纯PDT组[(25.83±0.45)%]，差异均有统计学意义( F＝28 134.564， P<0.05)，VEGF-C在联合实验组[(20.65±1.02)%]中表达量明显低于空白对照组[(67.51±1.48)%]、单纯NS-398组[(30.54±1.31)%]和单纯PDT组[(32.12±1.25)%]，差异均有统计学意义( F＝3 739.623， P<0.05)；ELISA可见COX-2在联合实验组[(26.58±0.27) μg/L]中表达量明显低于空白对照组[(35.14±0.22) μg/L]、单纯NS-398组[(30.29±0.31) μg/L]和单纯PDT组[(31.67±0.13) μg/L]，差异均有统计学意义( F＝2 972.978， P<0.05)，VEGF-C在联合实验组[(1.36±0.02) μg/L]中表达量明显低于空白对照组[(1.69±0.03) μg/L]、单纯NS-398组[(1.45±0.03) μg/L]和单纯PDT组[(1.47±0.04) μg/L]，差异均有统计学意义( F＝420.490， P<0.05)。 结论:NS-398和PDT两种措施联合可显著抑制QBC939细胞生长，促进细胞早期凋亡，其对QBC939细胞生长的抑制作用可能是通过抑制COX-2和VEGF-C的表达，进而促进细胞早期凋亡实现的。

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对SAP患者树突状细胞(DCs)成熟、分化的作用及参与炎症调节的机制。方法:采集郑州大学附属郑州中心医院行剖宫产的足月胎儿脐带4～5 cm，原代分离培养hUC-MSCs，采用流式细胞术进行表型鉴定和成脂、成骨染色。采集5例SAP患者外周血20 ml，采用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4、肿瘤坏死因子(TNF-α)进行诱导培养出DCs，根据培养方式不同分为DCs组、hUC-MSCs+DCs组、hUC-MSCs+DCs+NS398组(NS398为NF-κB下游调控基因COX-2的特异性抑制剂)。应用流式细胞术检测DCs表型，测定细胞培养24 h上清液中的IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6 、IL-10水平。采用蛋白质免疫印迹法检测Toll样受体4(TLR4)、IKKα及NF-κB-p65蛋白表达量。结果:成功培养出hUC-MSCs，其表面标志物CD 90、CD 105、CD 73表达阳性，并可向脂肪细胞、骨细胞分化。随着培养时间延长，DCs由未成熟向成熟分化。与DCs组比较，hUC-MSCs+DCs组的调节性DCs(regDCs)比例增加，其标志物CD 11b显著上调[ (14.26±1.25)%比(4.87±0.58)%]，CD 1a 、CD 11c显著下调[(2.81±0.34)%比(13.62±1.52)%、(3.88±0.5)%比(11.8±1.22)%]，差异均有统计学意义( P值均<0.05)。培养上清液IL-1β、INF-γ、IL-6表达下调，但差异无统计学意义；而促炎因子IL-1α显著降低[(14.91±2.58)ng/L比(30.19±7.75)ng/L]，抑炎因子IL-10显著升高[(17.03±4.69)ng/L比(1.83±0.14)ng/L]。NF-κB-p65、TLR4蛋白表达显著下调(0.74±0.02比0.97±0.01、0.89±0.01比1.72±0.01)，IKKα蛋白表达显著上调(1.12±0.01比0.21±0.01)，差异均有统计学意义( P值均<0.05)。与DCs组及hUC-MSCs+DCs组比较，hUC-MSCs+DCs+NS398组的NF-κB-p65与TLR4表达量显著下调(0.34±0.01比0.97±0.01、0.74±0.02，0.14±0.01比1.72±0.01、0.89±0.01)，而IKKα蛋白表达显著上调(1.68±0.01比0.21±0.01、1.12±0.01)，差异均有统计学意义( P值均<0.05)。 结论:hUC-MSCs能够抑制SAP患者DCs成熟、分化，并诱导出CD 11bhigh CD 1alow CD 11clow的regDCs参与免疫调节，其机制可能通过TLR4/IKKα/NF-κB/COX-2途径抑制炎症级联反应，发挥抗炎作用。

目的:研究光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)和选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂NS-398联合对人胆管癌细胞QBC939的抑制作用。方法:体外培养人胆管癌QBC939细胞株，分别设立PDT处理组、NS-398浓度组、二者联合组和空白对照组，将血卟啉衍生物(HPD)浓度(0、2、4、6、8、10 μg/ml)，光照强度(0、5、10、15 J/cm 2)和NS-398浓度(0、25、50、100、200 μmol/L)分别联合作用；利用CCK8法检测各组处理对QBC939细胞生长的相对抑制率；采用流式细胞实验检测QBC939细胞的凋亡情况；采用Transwell法检测QBC939细胞的体外侵袭情况。 结果:PDT和NS-398在体外均能单独抑制QBC939细胞生长，HPD浓度8 μg/ml，光照强度5 J/cm 2联合50 μmol/L的NS-398作用后，细胞生长抑制率达95%，二者联合组与PDT处理组、NS-398浓度组和空白对照组比较均有统计学差异( P<0.05)，继续增加二者的强度，细胞生长抑制率变化不明显；流式细胞实验表明PDT和NS-398联合作用能够明显促进QBC939细胞的早期凋亡，二者联合组的细胞凋亡率为(66.18±1.22)%，空白对照组、PDT处理组和NS-398浓度组的细胞凋亡率分别为(4.16±1.25)%、(22.19±1.17)%、(23.21±1.65)%，二者联合组与其它三组相比差异均有统计学意义( P<0.05)；HPD浓度4 μg/ml，光照强度5 J/cm 2联合25 μmol/L的NS-398作用后，QBC939细胞生长无明显抑制，但其体外侵袭能力降低，二者联合组的侵袭细胞数(8.16±1.65)少于空白对照组(31.22±1.25)、PDT处理组(18.09±1.17)和NS-398浓度组(19.21±1.72)，差异具有统计学意义( P<0.05)。 结论:PDT和NS-398联合作用可以促进QBC939细胞早期凋亡，抑制其侵袭能力，进而起到对QBC939细胞生长的抑制作用。

目的 探讨Notch信号通路参与肝癌细胞侵袭迁移的临床机制.方法 体外培养肝癌细胞系SMMC-7721、MH-CC97H及健康细胞状态正常非肿瘤干细胞系HL-7702.应用Transwell小室、BCA蛋白定量法评估并检测Notch信号通路表达情况.结果 肝癌组织当中的Notch阳性表达同肝癌分期、静脉癌栓等呈正相关(P＜0.05);正常非肿瘤肝细胞系与不同肝癌细胞系迁移侵袭能力比较,差异有显著统计学意义(P＜0.05);γ-分泌酶抑制剂(DAPT)、NS-398(高活性COX-2抑制剂)对肝癌细胞的迁移侵袭能力有显著影响(P＜0.05).结论 肝癌细胞迁移侵袭过程当中,Notch信号通路有重要影响,作用机制同Snail及COX-2表达存在联系.

目的 探讨阻断Notch信号通路对肝癌细胞迁移的和环氧化酶-2(COX-2)蛋白表达的影响.方法 在体外培养肝癌细胞系HepG2、Huh-7和正常非肿瘤细胞系HL-7702,在Transwell小室检测细胞的迁移能力,对不同肝癌细胞系及正常非肿瘤肝细胞系的侵袭迁移能力进行比较;采用Western Blot的方法检测COX-2、E-cadher-in、Snaill的蛋白表达;采用5μmol/L的 γ-分泌酶抑制剂(DAPT)阻断Notch信号通路,通过对肝癌细胞系HepG2、Huh-7和对照组(空培养基)细胞迁移侵袭的比较得出DAPT和NS-398阻断Notch信号通路对肝癌细胞迁移能力的影响.结果 不同肝癌细胞系及正常非肿瘤肝细胞系的侵袭迁移能力比较结果显示,HL-7702细胞系细胞的迁移和侵袭数量分别为(128.23±10.34)、(112.34±9.02)个,低于HepG2、Huh-7细胞系细胞迁移、侵袭数量,差异有统计学意义(P<0.05);DAPT和NS-398处理对肝癌细胞迁移能力的影响结果显示,加5μmol/L的DAPT后HepG2的细胞迁移侵袭数量分别为(213.36±9.02)和(197.53±11.27)个,Huh-7的细胞迁移侵袭数量分别为(201.74±11.23)和(179.63±9.26)个,采用50μmol/L NS-398后,HepG2的细胞迁移侵袭数量分别为(203.26±11.25)和(187.54±11.37)个,Huh-7的细胞迁移侵袭数量分别为(187.63±8.87)和(165.64±8.45)个.与对照组相比,使用DAPT或NS-398处理后的肝癌细胞在Transwell小室中迁移侵袭能力均显著降低,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);HepG2和Huh-7两细胞系在5μmol/L DAPT干预后,COX-2、Snail蛋白表达明显出现下调,而E-cadher-inl表达明显出现上调现象.结论 Notch信号通路在肝癌细胞侵袭迁移过程中起着非常重要的作用,阻断后细胞的迁移能力下降,Notch调控COX-2后其蛋白表达下调,然后调控Snail/E-cadherin的表达,从而改变肿瘤细胞的迁移过程.

目的 研究选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂NS-398和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)联合对胆管癌细胞QBC939凋亡的影响及机制. 方法 体外培养胆管癌QBC939细胞,设立NS-398组、DHA组、联合组和空白组,将0,25,50,100,150,200 μmol/L的NS-398和0,15,30,45,60,75 μg/ml的DHA分别联合作用于QBC939细胞;应用CCK8法检测QBC939细胞的生长抑制率;采用流式细胞术检测细胞凋亡;应用实时荧光定量PCR、Western blot和ELISA检测细胞中β-catenin和c-myc的表达. 结果 NS-398和DHA在体外均能抑制QBC939细胞生长,NS-398为100 μmol/L联合DHA为45 μg/ml作用后,细胞生长抑制率达90％ (F=5.85,P＜0.05),二者联合能明显促进QBC939细胞凋亡(F=8.16,P＜0.01).实时荧光定量PCR、Western blot和ELISA实验均显示联合能明显抑制β-catenin(F=7.61,P＜0.01)、(F=7.75,P＜0.01)、(F=8.17,P＜0.01)和c-myc(F=7.92,P ＜0.01)、(F=8.76,P ＜0.01)、(F=8.12,P＜0.01)表达.结论 NS-398和DHA联合能明显抑制QBC939细胞生长,促进早期凋亡,二者联合对QBC939细胞生长的抑制作用可能是通过抑制β-catenin和c-myc的表达,促进细胞早期凋亡.

二十二碳六烯酸(DHA)和NS-398均能诱导胆管癌细胞凋亡,抑制β-连环蛋白(β-catenin)和环氧合酶-2(COX-2)在细胞中表达可抑制增殖,促进凋亡[1].DHA和NS-398均有一定的平台效应,联合后研究其效益.一、材料与方法1.细胞计数试剂盒(CCK-8):分别将0、15、30、45、60、75 μg/ml DHA和0、25、50、100、150、200 μmol/L NS-398联合实验.2.流式细胞术:取CCK-8的最佳参数作实验组,另设DHA组、NS-398和空白组实验.3.实时荧光聚合酶链反应(PCR):提取mRNA行PCR反应比较表达.

目的 研究二十二碳六烯酸(DHA)联合选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养人胆管癌QBC939细胞株,分别设立DHA组、NS-398组、二者联合组和空白对照组.将0、15、30、45、60、75μg/ml的DHA和0、25、50、100、150、200μmol/L的NS-398分别联合作用于胆管癌QBC939细胞;应用CCK8法检测其对QBC939细胞生长的相对抑制率;采用流式细胞术检测QBC939细胞的凋亡情况;应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测QBC939细胞中β-连环蛋白(catenin)和COX-2两种因子的基因表达情况;应用SP免疫细胞化学法测定作用前后QBC939细胞浆中β-catenin和COX-2两种蛋白的表达情况;应用ELISA法测定QBC939细胞上清中两种蛋白分泌情况.结果 DHA和NS-398在体外均能单独抑制QBC939细胞生长.DHA浓度为45μg/ml,联合NS-398浓度为100μmol/L时,作用24小时后,细胞生长抑制率达到90.0％,实验组与DHA组、NS-398组和空白组差异均有统计学意义(P＜0.05).继续增加两种药物浓度,细胞生长抑制率变化不明显.流式细胞术显示,DHA联合NS-398能明显促进QBC939细胞早期凋亡;实时PCR显示二者联合能明显抑制QBC939细胞中β-catenin和COX-2基因表达;SP免疫细胞化学实验显示,二者联合能抑制QBC939细胞浆中β-catenin和COX-2两种蛋白表达;ELISA实验显示,二者联合能抑制QBC939细胞中两种蛋白的细胞外分泌.结论 DHA联合NS-398能明显抑制胆管癌QBC939细胞生长,促进胆管癌细胞早期凋亡.二者联合对胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用可能是通过抑制β-catenin和COX-2两种因子基因及蛋白水平的表达,进而促进胆管癌QBC939细胞的早期凋亡实现的.

目的:对1例发育迟缓患儿及其家系进行基因检测, 了解其基因突变的类型和遗传模式, 以对其进行临床诊断.方法:提取先证者及其家系成员的外周血DNA, 利用高通量测序技术对先证者进行基因筛查, 结合临床表型资料, 寻找候选基因致病位点, 结合Sanger测序技术对先证者及其家系成员进行致病位点验证.按照美国医学遗传学与基因组学学会 (American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG) 变异分类指南判断致病性.结果:高通量测序结果发现, 先证者MECP2基因、PTPN11基因存在杂合错义变异, 分别为第4号外显子c.398G＞A, p.Arg133His及第3号外显子c.188A＞G, p.Tyr63Cys.Sanger测序结果显示, MECP2基因变异遗传自母亲, 导致Rett综合征;PTPN11基因变异遗传自父亲, 导致努南综合征 (Noonan syndrome, NS).这2个错义变异均为致病性变异, 与先证者及其父母的临床表型相一致.结论:本研究通过高通量测序发现1例发育迟缓患儿存在2个不同基因的致病性变异, 导致同患2种不同的遗传性综合征, 提示遗传性疾病患者中可能同时存在2种或以上的疾病表型, 需加以重视.

目的 研究低强度高频率振动(low-magnitude high-frequency vibration, LMHFV)对成骨细胞生物学特性的影响.方法 建立LMHFV 加载MC3T3-E1 细胞模型,观察不同频率LMHFV 对 MC3T3-E1细胞OPG/RANKL浓度比的影响,获得OPG/RANKL浓度比最高的频率(F)为后续研究频率;以0 Hz为对照,观察LMHFV对MC3T3-E1 细胞碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN) mRNA和蛋白活性,及钙化结节形成的影响;LMHFV加载形成的条件培养液(CMF)孵育RAW264.7 细胞,观察CMF对破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、多核破骨细胞形成、TRAP mRNA及蛋白活性的影响;观察LMHFV对 MC3T3-E1 细胞环氧化酶2(COX-2)蛋白水平的表达及COX-2 抑制剂NS-398 对LMHFV影响MC3T3-E1细胞分化的作用.结果 30 Hz LMHFV获得OPG/RANKL浓度比最高,促进ALP、OCN mRNA及蛋白活性增加,增加钙化结节形成.30 Hz LMHFV形成的CM抑制RAW264.7 细胞向多核破骨细胞分化,抑制TRAP mRNA及活性;LMHFV可诱导COX-2 蛋白水平增加,NS-398 能抑制LMHFV促进成骨细胞分化.结论 30 Hz的LMHFV对MC3T3-E1 细胞OPG/RANKL浓度比及成骨分化具有积极的影响,通过调控成骨细胞OPG/RANKL浓度比间接抑制骨吸收,COX-2 通路参与了LMHFV对成骨细胞生物学特性的调节作用.