目的 在piggyBac(PB)转座子介导下,探索在HepG2细胞中实现多个药物代谢酶稳定共表达的策略,为建立体外药物代谢和肝毒性研究的理想细胞模型奠定基础.方法 首先选择3种目前针对大片段DNA使用较广的转染方法:Lipofectamine?LTX,GenJetTM(Ver.Ⅱ)和Neon?Transfection System,分别转染N端标记增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)和2A串联重组细胞色素3A4(CYP3A4)和CYP2C19的PB转座子质粒(pPB-CYP3A4-2A-2C19)至HepG2细胞,48 h后比较不同方法的转染效率和细胞毒性,确立高效低毒的HepG2细胞转染方法.然后选择该法进行转染,将设计的3组PB重组转座子:单基因转座子(PB-CYP3A4)、2A串联多基因转座子(PB-CYP3A4-2A-2C19)、多个单基因转座子混合物〔PB-CYP3A4, PB-CYP2C8,PB-CYP2A6,有机阴离子转运多肽1B1的PB转座子(PB-OATP1B1)〕分别转染HepG2细胞,利用嘌呤霉素和GFP进行单克隆细胞筛选:挑选具有抗性且表达GFP的细胞单克隆并进行扩大培养,采用实时荧光定量PCR、Western蛋白质印迹和高效液相色谱-串联质谱联用法分别检测各组药物代谢酶mRNA、蛋白质水平及酶活性,并进行统计分析.结果 3种转染方法比较发现,GenJetTM法的转染效率显著高于其他2种(P<0.01),介导Pegfp-N2和Ppb-CYP3A4-2A-2C19的转染效率分别高达(94.2±2.5)%和(89.3±3.3)%,且该法具有较低的细胞毒性.因此选择GenJetTM法进行后续PB转座子转染.分别转染3组PB重组转座子发现,单个转座子PB-CYP3A4和PB-CYP3A4-2A-2C19转染后,筛选获得的抗性细胞克隆中各个药物代谢酶在Mrna、蛋白质及活性水平均显著提高,其中2A可实现CYP3A4和CYP2C19药物代谢酶协同稳定表达;而多个转座子混合共转染细胞中,仅有随机几个基因表达;且各药物代谢酶基因的表达不均衡,仅CYP3A4药物代谢酶基因在单克隆细胞中表达水平明显升高.结论 GenJetTM法可成为PB重组转座子转染HepG2细胞的有效方法.PB转座子可介导基因稳定表达;但在实现多基因共表达时,与病毒载体法不同,理论上可行的PB多转座子共转染方法其基因表达效率下降,且各基因表达不均衡.相比之下,应用2A串联多个基因串联重组PB单转座子可实现各基因稳定表达.

piggyBac(PB)是一种能在多种动物细胞中进行转座的DNA转座子,作为一种转基因工具已被广泛应用于各种哺乳动物转基因研究中.针对不同物种对PB转座子进行改造,是提升其通用性的必要手段.为构建基于绵羊细胞进行转基因操作的通用型PB转座子载体,本研究对PB转座酶(PBase)基因进行绵羊密码子偏好性优化并将其克隆到pBNW-TP1载体中,成功构建了PB转座子载体pBNW-TP2.将pBNW-TP2转染到绵羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞中,利用G418筛选获取稳定转染细胞株;利用Tail-PCR检测稳定转染细胞株的PB转座位点,对细胞阳性克隆进行亚甲蓝染色;利用非配对t检验确认其转座效率.结果表明,pBNW-TP2成功介导了绵羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞转基因阳性细胞株的生产;PB转座位点检测表明pBNW-TP2能特异性整合到绵羊基因组TTAA位点,其整合位点倾向于功能基因间;亚甲蓝染色统计分析结果提示pBNW-TP2介导的转基因效率显著提升.本研究成功构建了绵羊通用型PB转座子载体pBNW-TP2,并在绵羊体细胞中对其特性进行验证和分析,为PB转座子在绵羊体细胞中开展转基因相关研究提供了科学依据.

目的 观察靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRv Ⅲ)的嵌合抗原受体修饰T细胞(EGFRv Ⅲ/2CAR-T)对肝癌细胞SMMC-7721的特异杀伤作用.方法 二代EGFRv Ⅲ CAR表达框(EGFRv Ⅲ/2CAR,1 374 bp)克隆入PiggyBac转座子载体PB513B-1的Xba Ⅰ和BamH Ⅰ位点,转座子载体(PB-EGFRv Ⅲ/2CAR)和转座酶双质粒电穿孔(1×20ms,840 v)转导人外周血T细胞,流式细胞术检测EGFRv Ⅲ/2CAR表达.Western blot法检测SMMC-7721中EGFRvⅢ表达.EGFRv Ⅲ/2CAR-T细胞和SMMC-7721细胞共培养,乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测特异杀伤作用、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测干扰素(IFN)-γ分泌水平.结果 重组载体PB-EGFRv Ⅲ/2CAR经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切、电泳分析及DNA测序证明基因片段连接无误、核酸序列正确.流式细胞术检测结果转座子/转座酶双质粒电穿孔外周血T细胞EGFRvⅢ/2CAR表达率为55.5％.Western blot显示SMMC-7721在相对分子质量145 000处EGFRv Ⅲ表达.EGFRv Ⅲ/2CAR-T和SMMC-7721共培养24h,LDH释放试验证明肿瘤特异性杀伤,与效靶比呈正比(E∶T为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1);ELISA检测到IFN-γ分泌量为(1 060.1 ±89.0) pg/ml,明显高于对照组(P=0.000).结论 靶向EGFRv Ⅲ的二代CAR-T细胞能够特异杀伤EGFRv Ⅲ+的肝癌细胞SMMC-7721.

目的 建立一种非病毒的T细胞基因转导方法,为CAR-T细胞免疫治疗提供基因修饰策略.方法 将CD19CAR表达框(1 470 bp)克隆人PiggyBac转座子载体PB513B-1的Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ位点,构建靶向CD19的PiggyBac转座子载体(pb19CAR);将转座子和转座酶双质粒,经电穿孔仪(1×20 ms 830 V/840 V/850 V)和核转仪(U014/T023)转导原代T细胞,优化转导程序,比较两种转导装置的效率及细胞存活率;用靶抗原CD19蛋白(5μg/ml)和CD3/CD28 mAb(5μg/ml)两种包被平板激活、白细胞介素(IL)-2(500 U/ml)和混合细胞因子IL-7(10 ng/ml)/IL-15(10 ng/ml)/IL-21(20 ng/ml)两种扩增方法,比较激活、扩增、CD19CAR表达和细胞表型.结果 转座子载体(pb19CAR)经Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切和基因测序确认构建成功.经流式细胞术及细胞活力计数仪检测,电穿孔仪转导效率及细胞活率均高于核转仪[(51.0±2.3)％比(36.5±1.8)％(P=0.000),(75.0±3.8)％比(60.0±3.0)％(P=0.000)];电穿孔后培养扩增12d流式细胞术检测CD19CAR表达显示靶抗原CD19蛋白组明显高于CD3/CD28 mAb组[(70.0±3.5)％比(54.0±2.7)％(P=0.000)]、细胞表型分析显示混合细胞因子组比IL-2组有更高比例的Tscm/Tscm-like(25.00±1.25)％比(12.20±0.60)％ (P =0.000)、Tcm细胞(10.20±0.51)％比(3.00±0.15)％(P=0.000).结论 pb19CAR/转座酶双质粒电穿孔具有较高的转导效率和细胞活率;靶抗原CD19蛋白刺激可优势扩增CAR-T细胞;混合细胞因子支持具有中央记忆和干细胞记忆表型的CAR-T细胞生长.

目的 探究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1[CDKN1A(P21)]对造血发生过程的影响.方法 对RUNX1b诱导过表达hES细胞系(RUNX1b/hESC)与小鼠主动脉-性腺-中肾区(AGM)基质细胞AGM-S3共培养4d细胞,使用多西环素(DOX)(1μg/mL)与RepSox(0.33 μmol/L)或不同浓度DOX(1、0.5、0.2、0.1μg/mL)诱导RUNX1b过表达时,以qRT-PCR技术检测P21与RUNX1b相对表达情况.利用基于转座子载体PiggyBac的PB-tet-on-OE真核诱导过表达系统,建立P21诱导过表达hES细胞系(CDKN1A/hESC).分别在CDKN1A/hESC与AGM-S3共培养d0、d2、d4、d6添加DOX诱导P21过表达,培养8d或14 d,通过流式细胞术(FACS)检测血细胞表面分子的变化情况,以判断诱导P21过表达对造血发生产生的影响.结果 qRT-PCR显示:P21表达量随着RUNX1b过表达上调,同时加入RepSox时表达基本处在正常水平,随着DOX浓度降低,RUNX1b与P21表达水平下降.在造血分化的早期,特别是共培养d0开始诱导P21过表达的共培养体系所产生的CD34-CD43+、CD34-CD45+与CD34+ CD45+细胞群相较于对照分别降低了85％,94％和78％,当共培养d6后诱导P21过表达上述现象消失.结论 P21可能参与了由RUNX1b诱导过表达所引起的人类早期造血发生的抑制效应;早期诱导P21过表达明显抑制造血细胞产生.

目的:探究T细胞携载人IL-12基因对T细胞生长和功能的影响.方法:构建表达人IL-12基因的PiggyBac转座子载体,在电转下,将携载IL-12基因的转座子系统导入新鲜分离的淋巴细胞获得持续稳定表达.通过T细胞表型分析及体外功能实验研究初步探讨T细胞携载IL-12基因的可行性.结果:借助电转可将携载有IL-12基因的PiggyBac转座子系统高效导入新鲜分离的淋巴细胞并获得高效稳定表达;IL-12的分泌可促进T细胞增殖,增加CD4阳性细胞百分比;携载IL-12基因的T细胞在肿瘤细胞刺激下可进一步促进IL-12分泌,增强T细胞的杀瘤活性.结论:在电场作用下,Piggybac转座子系统可将人IL-12基因高效载入并整合至T细胞基因组获得持续稳定表达,分泌的功能性IL-12可促进T细胞增殖,增强杀瘤活性.

目的:探讨表达人白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素15(IL-15)、干细胞生长因子(SCF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的piggyBac(PB)转座子系统在免疫缺陷小鼠体内的长效表达情况,为改善人源化小鼠模型中人免疫细胞的重建提供简单长效的新方法.方法:构建含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的PB转座子质粒(PB-GFP),构建含有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB转座子质粒(PB-5F).293T细胞分为阴性对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pLVTHM质粒)、瞬时转染组(转染PB-GFP质粒)和稳定转染组[共同转染PB-GFP和转座酶质粒(super-PB)].转染后每3 d,采用流式细胞术检测各组细胞中GFP阳性(GFP+)细胞百分率.将NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NCG)小鼠分为瞬时转染组和稳定转染组,瞬时转染组小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒,稳定转染组小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒和super-PB质粒.小鼠尾静脉高压注射后1、3、5和9 d及随后每周1次采血分离血清,ELISA法检测各组NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平.结果:PB-GFP转染293T细胞30 d后,稳定转染组GFP+细胞百分率(4.61％±0.42％)明显高于阳性对照组(0.58％±0.05％)和瞬时转染组(0.86％±0.10％)(P<0.05).NCG小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒,注射后第30天,稳定转染组小鼠血清中IL-6、IL-15和GM-CSF水平均高于瞬时转染组(P=0.048,P=0.051,P=0.045);注射后第60天,稳定转染组小鼠血清中仍能检测到IL-6、IL-15和GM-CSF.结论:体外验证了PB转座子系统的长效表达,成功构建了具有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB转座子载体的质粒,建立了长效稳定表达人IL-6、IL-15和GM-CSF的免疫缺陷小鼠模型.

目的:探索新型阳离子聚合物纳米载体mPEG-P(Asp-AED-g-HFB) (PAEF)和PiggyBac转座子介导嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰自然杀伤(natural killer,NK)细胞的基因转染方法,为肿瘤细胞免疫治疗制剂研发提供新策略.方法:制备PAEF/DNA(转座酶+转座子)复合物,通过Nano-ZSE动态光散射系统(Malvem Instruments)测量PAEF/DNA复合物的粒径分布和表面电位;DNA凝胶电泳验证PAEF的DNA包封率、释放性和稳定性,结合粒径电位选择进入细胞合适的N/P值;CCK-8细胞毒性实验分析不同N/P值条件下PAEF/DNA复合物的细胞毒性;荧光显微镜及流式细胞术检测细胞转染效率,评估PAEF基因转染载体的可行性.结果:PAEF可包裹DNA形成粒径100～150 nm的纳米复合物,后者易于介导DNA进入细胞;当N/P值为20时,PAEF即可实现DNA的完全包裹;在还原剂二硫苏糖醇(dithiothreotol,DTT)存在下,PAEF对DNA有良好的释放能力;N/P值为80时,PAEF/DNA复合物转染组的NK-92细胞存活率显著高于脂质体转染组[(72.50±3.9)％ vs(64.03±1.8)％,P＜0.05];荧光显微镜下观察发现,PAEF/DNA组荧光多、荧光强度大;流式细胞术显示最高转染效率为83.4％.结论:纳米载体PAEF通过静电吸附作用能够很好地包裹DNA,且生物相容性好,基因转导效率较高,成功制备的CAR-NK细胞为过继免疫治疗提供良好的实验基础.

旨在利用显微注射法对早期家蝇(Musca domestica L.)卵注射含有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的转座子载体,实现活体基因稳定表达并对其进行验证,为开展家蝇基因功能的研究奠定基础.文中自制适用于显微注射家蝇卵的硼硅酸盐玻璃微量注射针,摸索出家蝇卵壳的软化处理条件,以NanojectIII高精度微量注射器为主体构建适用于家蝇的显微注射技术平台;将含有眼部特异表达的3×P3启动子、EGFP的重组质粒PiggyBac-[3xP3]-EGFP与稳定遗传表达辅助质粒pHA3pig helper显微注射到处理过的家蝇卵中,待羽化观察眼部发光情况,检测EGFP的表达及转录水平.结果表明,将家蝇卵在漂白水中漂洗35s时卵的正常孵化率为55％,处理35 s的卵壳其硬度适宜注射且注射针头不易破碎;羽化后的家蝇眼部带有绿色荧光的占比约为3％,通过分子检测,家蝇的DNA和RNA中均扩增出EGFP特异片段,大小为750 bp.通过该技术平台,能够便捷、有效地实现报告基因在家蝇中的稳定表达,建立以家蝇为主体的生物反应器,为后续家蝇基因功能的研究提供一定参考价值.

目的 探讨建立转座子载体过表达外源肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSCs)转基因细胞系及其应用于脑胶质瘤裸鼠模型的疗效.方法 自主专门设计的PiggyBac转座子过表达系统,通过嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选制备稳定表达TRAIL基因的靶向HER2型和非靶向型的2种转基因细胞.将带有萤火虫荧光素酶标记的脑胶质瘤细胞(U87MG-FLUC)接种于免疫缺陷性小鼠(BALB/c-nu/nu)颅内,接种剂量为1×106个/只,接种7d后利用小动物活体成像仪对植瘤小鼠脑颅检测,确定颅内肿瘤的大小和位置,然后将胶质瘤裸鼠分为4组(n=8),分别注射2种表达TRAIL转基因hUC-MSCs(分别命名为target-TRAIL和untarget-TRAIL组),以及只注射非转基因hUC-MSCs(接种剂量均为1×106/只)或PBS(分别命名为WT-MSCs和PBS组,作为阴性对照),每周用小动物活体成像仪监测肿瘤信号的变化情况,约检测3～4周.结果 2种转基因细胞经过6次传代扩增后能稳定表达TRAIL基因,流式检测:绿色荧光蛋白(GFP)阳性(共表达TRAIL基因)的细胞比例达到93％～97％,且经过6次传代后均为MSC相关表面标志物CD34、CD45、HLA-DR阳性率＜0.1％,CD90阳性率＞99％,CD73阳性率＞98％,CD105阳性率＞60％.中位生存期(d):胶质瘤裸鼠经颅内注射untarget-TRAIL、target-TRAIL、WT-MSCs或PBS组分别为41 vs 39 vs 24 vs 23(P＜0.05).结论 过表达TRAIL转基因的hUC-MSCs-TRAIL细胞明显延长移植了脑胶质瘤的裸鼠的生存时间.