目的:建立实时荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌基因组内IS711转座酶基因（orfA基因）的拷贝数，并应用于布鲁氏菌种与生物型的鉴定。方法:构建基于Taqman探针法实时荧光定量PCR技术的orfA基因拷贝数的检测体系。设计bcsp31基因和orfA基因的引物和探针，应用实时荧光定量PCR方法同时检测同一菌株相同DNA浓度下的bcsp31基因和orfA基因含量，获得2个基因的循环数（CT值），再根据bcsp31基因和orfA基因CT值的差异，换算出待检测布鲁氏菌菌株基因组内orfA基因的拷贝数。同时，将布鲁氏菌16M菌株DNA进行2倍递减稀释，验证检测体系的稳定性。结果:当16M菌株DNA浓度相差2倍时，实时荧光定量PCR方法同时检测bcsp31基因和orfA基因，测得的CT值差值均值均为1.00，95%置信区间为0.95~1.05，标准差为0.17，变异系数为0.17。应用该检测体系检测30株布鲁氏菌菌株DNA中orfA基因的拷贝数，发现羊种生物1~3型菌株分别有6、9和7个拷贝数；猪种生物2型菌株有10个拷贝数，与其他4个猪种生物型（1、3~5）菌株拷贝数不同；绵羊附睾种菌株有37个拷贝数；8个牛种生物型（1~7、9）菌株拷贝数稳定在5~6个。结论:成功建立了一种检测布鲁氏菌orfA基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法，该方法能够鉴定部分布鲁氏菌种与生物型菌株。

目的:建立转座子突变文库，筛选高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKp)的新毒力基因。 方法:构建转座子突变文库，血清处理，通过转座子测序(transposon sequencing, Tn-seq)比较分析血清处理前后各基因突变株在文库中丰度变化，并对筛选出的基因进行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释和富集分析。结果:以处理后丰度低于初始丰度20%为界，共筛选出405个基因，其中351个基因在HS11286、NJST258_1、NTUH-K2044和RJF293等4株参考菌株中保守存在，占86.7%，10个基因为NTUH-K2044和RJF293两株高毒力株共有而低毒力株HS11286和NJST258_1缺失；荚膜多糖基因簇中基因如糖基转移酶基因 wzy、聚集蛋白基因 wzi、荚膜转运蛋白基因 wza等突变株在血清处理后不能检出，气杆菌素、沙门氏菌素等铁载体基因簇在各文库中的丰度变化不超过1倍；KEGG注释结果显示，注释最多的基因为参与氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢、碳水化合物代谢等。 结论:Tn-seq是功能基因筛选的可靠方法，本研究成功筛选出405个hvKp的候选新毒力基因，为后续深入研究hvKp的新毒力基因功能和调控机制提供实验依据。

目的:通过生物信息学方法挖掘与卵巢上皮性癌（卵巢癌）耐药相关的可作为竞争性内源RNA（ceRNA）的长链非编码RNA（lncRNA），并进行临床验证。方法:（1）挖掘与卵巢癌相关的lncRNA并构建ceRNA调控网络：综合应用文本挖掘、数据预测和网络构建等生物信息学方法，建立与卵巢癌耐药相关的潜在ceRNA调控网络，即lncRNA-微小RNA（miRNA）-mRNA调控网络。（2）临床验证：收集2008年6月至2016年10月在广西医科大学附属肿瘤医院行肿瘤细胞减灭术的卵巢癌患者共95例，其中铂类药物耐药患者54例（耐药组），铂类药物敏感患者41例（敏感组），采用实时荧光定量PCR技术检测两组卵巢癌组织中lncRNA的表达，分析lncRNA表达对卵巢癌患者预后的影响，并分析lncRNA表达对卵巢癌耐药的诊断效能。结果:（1）文本挖掘初步筛选出25个与卵巢癌发生、发展相关的差异表达lncRNA；亚细胞定位分析发现，有8个lncRNA存在于细胞质中；通过进一步数据挖掘、共线文献分析，预测其中的两个lncRNA分子［即生长阻滞特异性转录因子5（GAS5）和HOXC基因座转录因子（HOTAIR）］可作为关键ceRNA分子；构建ceRNA调控网络，GAS5与miRNA（即miR139-5p、miR-24-3p）及mRNA［即乳腺癌易感基因1（BRCA1）、肿瘤蛋白p53（TP53）、表皮生长因子受体（EGFR）、B细胞淋巴瘤2基因（BCL-2）、细胞癌基因（FOS）、H-Ras蛋白（HRAS）］组成ceRNA调控网络，HOTAIR与miRNA（即miR-30a-5p）及mRNA［即磷酸肌醇3激酶调控亚基2（PIK3R2）、TP53、丝蛋白（VIM）］组成ceRNA调控网络。（2）实时荧光定量PCR技术检测显示，与敏感组（设为1.0）比较，耐药组卵巢癌组织中GAS5的表达水平为2.1±1.6，HOTAIR的表达水平为3.5±1.9，两组分别比较，差异均有统计学意义（ P=0.011， P<0.01）；Cox回归模型多因素分析显示，GAS5、HOTAIR表达为影响卵巢癌患者无病进展生存率和总生存率的独立危险因素（ P<0.05）。GAS5与HOTAIR联合检测诊断卵巢癌的受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）为0.871，显著高于GAS5单独检测和HOTAIR单独检测（AUC分别为0.678、0.863），分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.05）。 结论:GAS5与HOTAIR高表达与卵巢癌耐药密切相关，可作为卵巢癌化疗反应的潜在预测指标；GAS5与HOTAIR联合检测对卵巢癌患者具有一定的诊断效能。这种利用ceRNA调控网络预测关键分子的方法，为卵巢癌的诊断和治疗提供了新的思路。

目的:分析黏质沙雷菌携带KPC-2型碳青霉烯酶的相关质粒特征。方法:4株碳青霉烯类抗生素耐药的黏质沙雷菌来自2016年我院肝胆病区的4位患者，使用仪器BD Phenix-100鉴定菌株并测定最小抑菌浓度(MIC)，脉冲场凝胶电泳分析菌株之间的同源性，改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型，PCR及产物测序检测基因型，接合试验检测质粒的转移性，质粒全基因组测序后比对，并分析其特征，使用软件DNAMAN比对复制起始蛋白氨基酸序列，软件MEGA7.0 Neighobor-Joining法构建系统发育树。结果:4株黏质沙雷菌对碳青霉烯类抗生素均表现耐药，菌株具有同源性，Hodge试验为阳性，碳青霉烯酶基因型为 blaKPC-2，接合试验阳性；质粒为42 742 bp的环状DNA，具有incX6质粒的类似骨架和相似的复制起始蛋白氨基酸序列，并和incX6具有共同的节点； blaKPC-2处于由Tn3家族转座子、重组酶基因、△ISKpn6和ISkpn27等插入元件构成的耐药核心区。 结论:未知质粒类型为incX6-like， blaKPC-2位于质粒的△Tn6296转座子上；携带KPC-2的此类质粒的细菌应引起重视。

目的:分析一株同时产KPC-2和NDM-5碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌耐药基因特征。方法:肺炎克雷伯菌KPN-hnqyy分离自我院血液科一位患者的粪便标本，使用仪器BD Phenix-M50鉴定菌株并测定最小抑菌浓度；酶联免疫层析试验和PCR方法检测碳青霉烯酶基因型；接合试验检测相关质粒的转移性；PacBio和Illumina平台对菌株全基因组测序，并在BacWGSTdb数据库中检索菌株MLST分型、耐药基因和质粒类型，使用软件Easyfig_2.2.3比对基因组和开放读码框序列，BRIG v0.95生成可视化质粒圈图。结果:肺炎克雷伯菌KPN-hnqyy对碳青霉烯类抗生素耐药，MLST分型为ST11型， blaKPC-2和 blaNDM-5碳青霉烯酶基因阳性；接合子 blaKPC-2基因阳性， blaNDM-5阴性；全基因组测序显示菌株含有1个染色体和3个质粒；肺炎克雷伯菌KP69和KP19-2029等与本研究菌株染色体基因组相似性大于99.9%，且其各自携带的不同种类的质粒上含有相似的IncR和IncFⅠ耐药基因融合区， blaKPC-2基因位于此融合区中一个由Tn3-△Tn4401-Tn1721/Tn1722序列演化而来的两端插入IS26转座酶基因的结构中； blaNDM-5基因位于一种含有噬菌体插入片段特殊质粒的Ⅰ型转座子上，两端也插入了IS26转座酶基因。 结论:ST11型肺炎克雷伯菌携带 blaKPC-2的IncR和IncFⅡ耐药基因融合区与染色体基因组可能一起广泛存在，特殊质粒携带的 blaNDM-5基因可能是通过IS26转座元件介导的基因重组方式偶然获得；携带 blaKPC-2基因的ST11型肺炎克雷伯菌在中国广泛传播并能通过IS26转座元件获得其他碳青霉烯酶基因的能力应引起重视。

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)在临床高度流行，由于缺乏有效治疗药物而带来了显著挑战。 blaKPC-2编码的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶-2(KPC-2)是CRKP产生碳青霉烯抗性的主要原因之一。在中国和其他亚洲地区，Tn1721和IncFⅡ质粒是 blaKPC-2在缺乏规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)和限制-修饰(R-M)系统的 Kpn ST11之间转移的主要载体。转座子的结构对耐药基因的转座频率有明显影响，这可能和不同转座子的转座模式有关系。 blaKPC-2在ST11中有流行优势与ST11免疫缺陷有重要联系，用重新设计的CRISPR/Cas3系统通过接合实验传递入ST11型肺炎克雷伯菌，高危IncFⅡ质粒可以被成功剪切，从而使ST11型CRKP恢复对抗生素的敏感性，这为CRKP的临床治疗和预防提供了新思路。

目的:对艰难拟梭菌630（Cd630）菌株和致病决定区基因座（PaLoc）敲除突变株（ΔPaLoc）进行转录组测序和分析，获得Cd630野生型菌株和ΔPaLoc基因的差异性表达谱，并测定野生型Cd630菌株和ΔPaLoc突变株的细胞毒力，为构建艰难拟梭菌全菌减毒疫苗奠定基础。方法:对Cd630菌株和ΔPaLoc敲除突变株进行转录组测序，接着对差异表达基因进行筛选，随后对差异基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。最后在非洲绿猴肾细胞（Vero）和人克隆结肠腺癌细胞株（Caco-2）中进行Cd630野生型菌株和ΔPaLoc敲除突变菌株的细胞毒性验证实验。结果:转录组数据表明ΔPaLoc突变株毒素基因 tcdA、 tcdB未转录。 CD630_36010、 CD630_020910、 CD630_02080和 cel等基因分别上调17.92、11.40、8.93和7.55倍；编码高丝氨酸脱氢酶的 hom2基因、孢子形成蛋白基因 CD630_15810、锌结合脱氢酶基因 CD630_23230、1-磷酸半乳糖醇 5-脱氢酶基因 CD630_23240分别下调为野生型的0.06、0.075、0.133和0.183倍。GO和KEGG富集分析结果表明，ΔPaLoc突变株差异转录基因主要富集于密度感应系统、ABC运输系统、双组分系统、磷酸转移酶（PTS）系统、糖代谢通路以及万古霉素耐药相关的通路等。细胞毒力实验结果表明野生型Cd630菌株对Vero细胞和Caco-2细胞具有毒力，ΔPaLoc突变株丧失对Vero细胞和Caco-2细胞的毒力。 结论:通过对Cd630和ΔPaLoc突变株进行转录测序，表明毒素基因未转录，其他差异性基因可为进一步研究ΔPaLoc突变株生理生化特征提供指引。细胞毒力实验表明，ΔPaLoc突变株丧失了对Vero细胞和Caco-2细胞的毒力，ΔPaLoc突变株为艰难拟梭菌全菌减毒疫苗的构建奠定了基础。

细菌抗生素耐药已成为当今世界面临的严峻问题，携带耐药基因的可移动遗传元件(mobile genetic elements，MGEs)在同种或不同种细菌之间的快速传播加速了耐药性的形成，这给临床治疗细菌感染带来了巨大挑战。插入序列(insertion sequence，IS)是最简单的MGE，其编码一个转座酶基因且它的两侧存在反向末端重复序列。IS91家族是目前已知的26种插入序列家族成员之一，其名下现有34名家族成员。近期研究表明，IS91家族的许多成员与抗生素耐药性密切相关，因此本文将从IS91家族的发现、遗传特征、IS91与插入序列共同区(ISCR)的异同以及其与耐药和毒力基因传播的关系等方面展开综述，以期为未来细菌耐药性研究提供参考。

目的:分析不同性别健康体检人群握力提升与身体成分及代谢紊乱改善的相关性。方法:本研究为回顾性队列研究，连续选取2018年1月至2022年11月于北京大学第三医院体检中心先后完成≥2次健康体检和握力测试的600例受检者，收集其一般资料、体格检查、生化指标、身体成分及握力结果。第1次体检进行握力测试后根据个人测评结果给予运动建议进行适当抗阻力量练习，举行1次健康讲座，每星期通过微信公众号推送健康运动相关信息，第2次体检同时完成握力测试，计算前后2次测试结果的差值变化，采用广义估计方程分析不同性别健康体检人群握力提升与身体成分及代谢紊乱改善的相关性。结果:男性及女性第2次体重指数［（25.50±3.66）比（25.33±3.74）kg/m 2、（22.41±3.55）比（22.25±3.46）kg/m 2］、握力［（42.71±7.30）比（41.77±7.36）kg、（25.28±5.30）比（23.98±4.87）kg］均显著高于第1次，舒张压［（72.79±10.30）比（74.47±9.85）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）、（66.93±8.90）比（68.92±9.42）mmHg］、同型半胱氨酸［（17.96±14.09）比（19.27±14.26）μmol/L、（9.47±3.91）比（10.26±3.90）μmol/L］均显著低于第1次（均 P<0.05）；男性第2次低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）显著低于第1次［（2.94±0.78）比（3.00±0.69）mmol/L］，女性第2次收缩压、尿酸显著低于第1次［（109.34±12.85）比（110.54±12.32）mmHg、（276.91±62.46）比（287.16±68.78）μmol/L］，腰臀比显著高于第1次（85.8%±5.1%比85.4%±5.0%）（均 P<0.05）。男性天冬氨酸氨基转移酶下降（ OR=0.932，95% CI：0.888~0.978）、骨骼肌指数升高（ OR=75.370，95% CI：29.012~195.806）均与握力提升呈正相关（均 P<0.05）；女性同型半胱氨酸下降（ OR=0.876，95% CI：0.782~0.982）、糖化血红蛋白下降（ OR=0.423，95% CI：0.222~0.805）、骨骼肌指数升高（ OR=22.918，95% CI：11.114~47.256）均与握力提升呈正相关（均 P<0.05）。 结论:不同性别健康体检人群握力提升与身体成分及代谢紊乱改善趋势呈正相关。

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础.方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1.分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3.通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测.结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2 000 bp的基因片段,与预期大小相符.昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52 000,与预期相符.WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应.结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件.