目的:构建呈现人白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)抗原肽的Qβ噬菌体病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗.方法:将人IL-13抗原肽经基因重组插入Qβ噬菌体衣壳蛋白(CP)的C端.在BL21细菌中,经IPTG诱导CP及C端接有IL-13抗原肽的CP(CP/IL-13)同时表达.以硫酸铵沉淀及蔗糖密度梯度离心进行VLPs纯化及分析嵌合VLPs的存在,以HPLC分析VLPs纯度,以电镜观察颗粒形态.小鼠经皮下免疫VLPs后采集血清,以ELISA检测人IL-13特异性IgG抗体水平.结果:重组蛋白CP与CP/IL-13获得成功表达,两者在密度梯度离心中有一致的、与QβVLPs相同的沉降行为,而CP/IL-13单独无Qβ颗粒行为.经纯化获得了高纯度颗粒,嵌合颗粒与Qβ颗粒形态相似.此外,该VLPs疫苗诱导小鼠产生了IL-13特异的抗体应答.结论:利用共表达策略可成功构建呈现人IL-13抗原表位的嵌合VLPs,为以主动免疫方式调控IL-13在疾病中的病理作用,提供了具有临床应用潜能的疫苗形式.

目的 基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含A群轮状病毒(Rotavirus,RV)检测靶标的装甲RNA(Rotavirus armored RNA,AR-RV),并开展系统的初步定值、均匀性、稳定性研究.方法 人工合成核酸片段QβSNRV,该片段5'端至3'端依次为Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列、RV检测靶标cDNA序列、多克隆位点序列,并将其克隆到pET-28a(+)载体中构建重组质粒pET-QβSNRV.将pET-QβSNRV转化大肠埃希菌BL21 (DE3)并诱导表达,利用氯化铯密度梯度超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析纯化AR-RV后电镜观察,并参照GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》规定的方法与原则对制备的AR-RV开展定值、均匀性和稳定性研究.结果 十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果证实重组质粒在大肠埃希菌中有目的条带表达,大小约为14.1 kDa;经氯化铯密度梯度超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析纯化的AR-RV无杂蛋白干扰;电镜下可见结构完整的病毒样颗粒,大小约为25 nm;定值结果显示,AR-RV中检测靶标RNA的含量为(1.02±0.3)×107 copies/μl;均匀性分析结果为F=0.66＜F005(9.20),表明样品均匀性良好;稳定性结果表明,AR-RV在37℃可保存15d、25℃可保存15d、4℃可保存50 d、-20℃至少可保存270 d、-80℃至少可保存360 d.结论 本研究基于Qβ噬菌体制备的AR-RV拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为RV分子检测提供安全、稳定的标准参考样品.

[背景]目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性.[目的]基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (HepatitisAvirus armored RNA,AR-HAV),并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品.[方法]人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察.通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究.[结果]SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25 nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为(2.57±0.12)× 107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23＜F0.05 (9,20),证实AR-HAV的均匀性良好;稳定性结果表明,AR-HAV在可37℃保存9d,25℃保存25 d,4℃保存40 d,-20℃保存180 d,-80℃至少保存360 d.[结论]基于Qβ噬菌体制备的AR-HAV拷贝数高,具有良好的均匀性和稳定性,可为HAV的分子检测提供安全、稳定的标准参考样品.

目的:利用大肠杆菌原核表达系统制备噬菌体QβVLPs,验证其自组装能力,纯化后免疫动物以确定其免疫原性,同时制备兔多克隆抗体验证其在哺乳动物细胞中内化能力.方法:合成pET-28-Qβ-CP质粒,利用大肠杆菌原核表达系统制备Qβ VLPs,通过蔗糖密度梯度离心纯化VLPs,将经凝胶层析柱Sephacryl S-400纯化的Qβ VLPs用透射电镜观察颗粒形态;纯化后的QβVLPs加入或不加入佐剂分别免疫新西兰兔,获得血清后用Protein G纯化得到兔多克隆抗体,通过 Western blot确定制备的兔多克隆抗体特异性,并利用间接免疫荧光法对Qβ VLPs的细胞内化能力进行鉴定.结果:制备并获得纯度较高的Qβ VLPs,通过透射电镜观察到大量直径约为28 nm的颗粒;Western blot结果表明制备的兔多克隆抗体能特异性识别Qβ VLPs,且在免疫实验中加入佐剂与不加入佐剂分别免疫动物,对抗体水平的影响不显著.间接免疫荧光法结果表明QβVLPs在哺乳动物细胞中具有内化能力.结论:成功制备QβVLPs为后续研发以噬菌体Qβ VLPs为载体的相关疫苗奠定基础.