目的 探究 SCFβ-TrCP泛素化降解转录因子激活增强子结合蛋白 4(transcription factor-activated enhancer-binding protein 4,TFAP4)对结直肠癌上皮间质转化的影响.方法 体外培养人结肠腺癌细胞 SW480,分别用不同浓度的 MLN4924 处理24h,然后采用 Western blot法检测内源性 TFAP4 蛋白水平变化.在 MLN4924 处理的基础上,加入 CHX分别干预不同时间,检测TFAP4 的蛋白半衰期和泛素化水平差异.在 CHX 干预的 SW480 细胞中过表达带 FLAG 标签的 TrCP-1,探究 β-TrCP 对TFAP4 表达的影响,通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验检测过表达或敲低 β-TrCP 不是因为影响了其他信号通路而改变TFAP4 的水平.将TFAP4 上 135 位的E突变为A,139 位的S突变为A,然后在CHX干预的SW480 细胞中转染结构域突变的 TFAP4,测定 TFAP4 半衰期和泛素化水平变化.CK1/CK2/GSK3 磷酸化关键酶抑制剂对 SW480 细胞进行干预,Western blot法检测TFAP4 水平,随后检测CK2 抑制剂对TFAP4 泛素化水平的影响,通过划痕实验分析细胞迁移能力,通过Tran-swell实验分析细胞侵袭能力.结果 TFAP4 随着 MLN4924 处理浓度变化呈剂量依赖式增加,MLN4924 处理能够显著延长内源TFAP4 蛋白的半衰期,TFAP4 和 CK2 存在相互作用,CK2 抑制剂能降低 TFAP4 泛素化水平,蛋白的半衰期得到明显延长,敲低β-TrCP引起 TFAP4 的降解受到明显抑制,β-TrCP与 TFAP4 直接相互作用,并促进其被泛素化,TFAP4 中 E135A 和 S139A 位点突变延长其半衰期,沉默 β-TrCP能促进细胞增殖和迁移.结论 SCFβ-TrCP可能通过泛素化修饰降解 TFAP4,从而抑制结直肠上皮间质转化的发生,进而抑制肿瘤的浸润、转移,可为结直肠癌治疗提供新的思路.

泛素-蛋白酶体系统是维持细胞内蛋白质稳态和功能的重要调节途径,泛素化参与调节细胞的增生、分化和存活,泛素化调节异常可导致代谢性骨病、肿瘤等疾病的发生.越来越多的证据表明泛素-蛋白酶体系统参与调控成骨细胞功能和骨形成.泛素连接酶(E3 ubiquitin ligases,E3)作为泛素和底物蛋白之间的衔接分子可特异性识别底物,在骨形成相关蛋白调节和骨转换过程中具有重要的意义.既往研究表明E3连接酶通过介导酪氨酸激酶受体、信号蛋白和转录因子等参与成骨细胞增生、分化、存活和骨形成的调节.Smurf1、Cbl和SCFβ-TrCP等E3连接酶可特异性介导Runx2、MEKK2、JunB、β-catenin、Gli2、ATF4等成骨细胞分化重要调节蛋白的降解,抑制成骨功能.E3连接酶作为促进骨形成和减少骨丢失理想的治疗靶标,具有广阔的研究前景.本文对E3连接酶在骨形成调节中的作用及机制进行回顾和总结.

Wnt signaling has emerged as a major regulator of tissue development by governing the self-renewal and maintenance of stem cells in most tissue types.As a key upstream regulator of the Wnt pathway,the transmembrane E3 ligase ZNRF3 has recently been established to play a role in negative regulation of Wnt signaling by targeting Frizzled (FZD) receptor for ubiquitination and degradation.However,the upstream regulation of ZNRF3,in particular the turnover of ZNRF3,is still unclear.Here we report that ZNRF3 is accumulated in the presence of proteasome inhibitor treatment independent of its E3-ubiquitin ligase activity.Furthermore,the Cullin 1-specific SCF complex containing β-TRCP has been identified to directly interact with and ubiquitinate ZNRF3 thereby regulating its protein stability.Similar with the degradation of β-catenin by β-TRCP,ZNRF3 is ubiquitinated by β-TRCP in both CKI-phosphorylation-and degron-dependent manners.Thus,our findings not only identify a novel substrate for β-TRCP oncogenic regulation,but also highlight the dual regulation of Wnt signaling by β-TRCP in a context-dependent manner where β-TRCP negatively regulates Wnt signaling by targeting β-catenin,and positively regulates Wnt signaling by targeting ZNRF3.