目的:运用基因芯片技术筛查与黑素瘤相关的DNA异常甲基化位点，初步构建黑素瘤特异性甲基化谱。方法:采用Illumina Human Methylation 450K全基因组甲基化芯片对6例黑素瘤组织及其瘤旁组织标本进行全基因组DNA检测，得出差异DNA甲基化位点。采用Gene Ontology（GO）富集分析及KEGG_Pathway分析了解基因功能。结果:基因芯片检测结果显示，黑素瘤组织与瘤旁组织存在差异甲基化位点，共27 779个，其中16 673个为高甲基化位点，11 106个低甲基化位点。提高筛选条件为 P < 0.01、︳Δβ︳> 0.2，过滤掉所有单核苷酸多态性相关探针、位于XY染色体上的探针以及交叉反应的探针，共筛选得到4 883个差异甲基化位点，其中1 459（30%）个位于启动子区（包括TSS1500、TSS200、5′UTR、1st Exon）。GO富集分析显示，差异甲基化基因参与的生物学过程主要包括细胞生长、分化、黏附、运动迁移、信号转导及转录调控等。KEGG_Pathway分析显示，差异甲基化基因主要参与黏着斑、癌症通路、转化生长因子β信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、黑素生成、趋化因子信号通路、黏合连接、钙信号通路、细胞黏附分子、MAPK信号通路、Wnt信号通路、JAK-STAT信号通路。基于"启动子区高甲基化位点对应的前16个基因、出现甲基化频率最高（CpG位点≥ 7）的基因、具有一定的功能或参与某条信号通路"条件，选出8个基因（ KAAG1、 DGKE、 SOCS2、 TFAP2A、 GNMT、 GALNT3、 ANK2、 HOXA9）作为黑素瘤候选生物标志物。 结论:黑素瘤组织存在较多高甲基化基因，8个差异甲基化基因有可能作为黑素瘤的生物标志物。

Char综合征是一种罕见的常染色体显性遗传病，以动脉导管未闭、面部畸形和指/趾发育异常为主要特征，并可能合并多乳头、牙齿发育异常、睡眠障碍等表现。 TFAP2B已被证实为神经嵴衍生和发育相关的基因，现已发现该基因的多种变异。骨形态发生蛋白信号在胚胎发育中发挥重要的作用，参与肢体生长和模式形成、调控神经嵴细胞的发育等。 TFAP2B是骨形态发生蛋白2和4的上游调控基因，其变异可能通过影响骨形态发生蛋白的表达造成神经嵴细胞增殖异常，进而导致多器官发育不全综合征。此外， TFAP2B变异也可能仅导致动脉导管未闭、而非典型的Char综合征。

目的:探讨转录因子激活增强子结合蛋白4(TFAP4)在胃癌中的表达及对预后的影响，并观察TFAP4在胃癌细胞迁移和侵袭过程中发挥的作用。方法:通过生物信息学分析，获取TFAP4在胃癌中的表达及在胃癌患者的预后中所起到的作用。采用Transwell小室法及划痕实验检测TFAP4对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。应用蛋白质印迹法(Western blot)检测敲低TFAP4后上皮-间充质转化(EMT)相关通路蛋白的表达变化。对独立样本采用 t检验。 结果:基因表达谱交互分析(GEPIA2)网站对胃癌组织的RNA测序(RNA-seq)数据进行分析，结果显示TFAP4在胃癌组织中高表达( t＝32.070， P<0.01)，差异有统计学意义。生存分析(KM-PLOTTER)网站对TFAP4进行生物信息学分析，TFAP4为胃癌预后的危险因素。划痕实验结果显示，敲低TFAP4的实验组在划痕48 h后相较于对照组迁移距离更短。Transwell实验结果显示，敲低TFAP4的实验组在24 h内穿膜细胞数量显著低于对照组[(83.000±3.786)个比(186.700±4.055)个， t＝18.690， P<0.05]，差异有统计学意义。Western blot结果显示，敲低TFAP4的表达后，上皮间充质转化(EMT)通路相关蛋白N-钙黏蛋白及基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达水平随之降低。 结论:TFAP4在胃癌中高表达，和不良预后呈正相关，具有促进胃癌细胞迁移和侵袭的作用。

目的:探讨转录因子激活增强子结合蛋白4(TFAP4)在胃癌中对LINC01235表达的调控作用。方法:通过生物信息学分析，获取TFAP4可在胃癌中调控的LINC01235。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测在胃癌细胞中敲低TFAP4后LINC01235的表达变化。应用染色质免疫共沉淀(ChIP)法验证TFAP4可以结合LINC01235的启动子区域调控其转录。采取双荧光素酶报告实验计算相对荧光活性验证启动子区域的单核苷酸多态性(SNP) rs34667091可以促进转录。对独立样本采用 t检验。 结果:肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中胃癌RNA-seq数据进行分析，可见LINC01235的高表达与不良预后明显相关( P<0.01)。JASPAR网站预测TFAP4可以调控LINC01235的表达。在胃癌细胞系中敲低TFAP4的表达后，LINC01235的表达水平随之降低。ChIP实验结果显示，与阴性对照组IgG比较，TFAP4与LINC01235的启动子区域结合富集百分比较高(0.000 299±2.129e-005比0.001 249±1.985e-005， t＝32.640， P<0.01)，差异有统计学意义。双荧光素酶报告实验结果显示，与正常对照组比较，LINC01235启动子区域的SNPs缺失后，TFAP4与启动子区域结合的相对荧光活性降低(1.000±0.207比0.341±0.031， t＝3.151， P<0.05；1.000±0.156比0.157±0.042， t＝5.221， P<0.05)，差异均有统计学意义。 结论:LINC01235的表达水平在胃癌中和不良预后呈正相关，TFAP4可以调控LINC01235的转录，LINC01235的启动子区域的SNP rs34667091可作为增强子。

目的:探讨全基因组测序筛选非小细胞肺癌(NSCLC)敏感甲基化位点的肺癌早期预警体系的构建。方法:本研究选择2014年3月至2016年11月在江南大学附属医院肿瘤科接受NSCLC手术切除的患者。实验分为两组：正常组织、非小细胞肺癌组织，通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测NSCLC细胞中切除修复交叉互补基因1(ERCC1)、β-微管蛋白Ⅲ(TUBB3)和核糖核苷还原酶调节因子1(RRM1) mRNA的表达；通过全基因组测序检测NSCLC细胞甲基化在基因上分布，使用测序数据进行胞嘧啶(C)-磷酸(p)-鸟嘌呤(G)甲基化图谱分析(CpG甲基化分析)，组蛋白修饰数据分析组蛋白修饰和DNA甲基化之间的关系，通过蛋白质免疫检测正常组织和非小细胞肺癌组织中组蛋白甲基化蛋和甲基化相关酶的表达。 t检验(或Wilcoxon秩和检验)和 χ2检验(或Fisher精确检验)分别用于分析连续和分类变量。Pearson(或Spearman)的秩相关系数用于分析两个连续变量之间的相关性。使用R软件(版本3.1.1)进行统计分析。 结果:与对照细胞比较，NSCLC细胞中ERCC1[(0.78±0.14)比(0.12±0.04)， χ2＝6.370， P<0.05]、TUBB3[(0.48±0.11)比(0.08±0.02)， χ2＝1.240， P<0.05]和RRM1 mRNA[(0.52±0.07)比(0.05±0.01)， χ2＝5.360， P<0.05]的表达下调表达；NSCLC组甲基化水平在转录起始位点升高，在基因间区降低( χ2＝3.140， P<0.05)；NSCLC组发现9个CpG的甲基化敏感位点(RUNX3、MIR196A1、HOXA11、OTP、GATA4、PTPRU、SLC15A3、ZIC1和TFAP2B)；NSCLC组与对照组比较，组蛋白乙酰化(H3K9ac[(43.57±8.84)比(10.64±4.35)， χ2＝8.730， P<0.05]和H3K27ac[ (40.52±8.64)比(9.67±3.58)， χ2＝5.470， P<0.05])和组蛋白甲基化(H2az[(42.56±9.74)比(12.47±6.05)， χ2＝7.420， P<0.05]，H3K4me1[(37.47±6.42)比(15.46±7.34)， χ2＝5.380， P<0.05]，H3K4me2[(50.37±10.24)比(9.47±6.54)， χ2＝9.270， P<0.05]，H3K4me3[(52.37±6.49)比(10.58±5.88)， χ2＝1.690， P<0.05]和H3K79me2[(34.55±6.42)比(11.23±6.94)， χ2＝3.450， P<0.05])降低；NSCLC组DNMT1(1.88±0.24)比(0.12±0.01)， χ2＝5.430， P<0.05]、DNMT3a(1.75±0.36)比(0.49±0.11)， χ2＝7.890， P<0.05]、DNMT3b(0.88±0.14)比(0.13±0.05)， χ2＝1.360， P<0.05]、H3K4me3(2.53±0.35)比(0.35±0.08)， χ2＝5.440， P<0.05]和H3K9me2(0.55±0.07)比(0.05±0.01)， χ2＝3.270， P<0.05]下调表达( P<0.05)。 结论:组蛋白修饰和DNA甲基化密切相关，组蛋白甲基化和甲基化相关酶的表达也受到影响，甲基化敏感位点可以作为早期检测NSCLC的生物标志物。

目的 探究 SCFβ-TrCP泛素化降解转录因子激活增强子结合蛋白 4(transcription factor-activated enhancer-binding protein 4,TFAP4)对结直肠癌上皮间质转化的影响.方法 体外培养人结肠腺癌细胞 SW480,分别用不同浓度的 MLN4924 处理24h,然后采用 Western blot法检测内源性 TFAP4 蛋白水平变化.在 MLN4924 处理的基础上,加入 CHX分别干预不同时间,检测TFAP4 的蛋白半衰期和泛素化水平差异.在 CHX 干预的 SW480 细胞中过表达带 FLAG 标签的 TrCP-1,探究 β-TrCP 对TFAP4 表达的影响,通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验检测过表达或敲低 β-TrCP 不是因为影响了其他信号通路而改变TFAP4 的水平.将TFAP4 上 135 位的E突变为A,139 位的S突变为A,然后在CHX干预的SW480 细胞中转染结构域突变的 TFAP4,测定 TFAP4 半衰期和泛素化水平变化.CK1/CK2/GSK3 磷酸化关键酶抑制剂对 SW480 细胞进行干预,Western blot法检测TFAP4 水平,随后检测CK2 抑制剂对TFAP4 泛素化水平的影响,通过划痕实验分析细胞迁移能力,通过Tran-swell实验分析细胞侵袭能力.结果 TFAP4 随着 MLN4924 处理浓度变化呈剂量依赖式增加,MLN4924 处理能够显著延长内源TFAP4 蛋白的半衰期,TFAP4 和 CK2 存在相互作用,CK2 抑制剂能降低 TFAP4 泛素化水平,蛋白的半衰期得到明显延长,敲低β-TrCP引起 TFAP4 的降解受到明显抑制,β-TrCP与 TFAP4 直接相互作用,并促进其被泛素化,TFAP4 中 E135A 和 S139A 位点突变延长其半衰期,沉默 β-TrCP能促进细胞增殖和迁移.结论 SCFβ-TrCP可能通过泛素化修饰降解 TFAP4,从而抑制结直肠上皮间质转化的发生,进而抑制肿瘤的浸润、转移,可为结直肠癌治疗提供新的思路.

目的 探讨四君子汤对胃癌肿瘤干细胞标志物活性及转录因子激活增强子结合蛋白(TFAP)4 蛋白的作用机制.方法 SGC-7901 干细胞分为A组(SGC-7901 干细胞)、B组(SGC-7901 干细胞在75 μl 2.5%大鼠四君子汤含药血清中培养)、C组(SGC-7901 干细胞在 75 μl 5%大鼠四君子汤含药血清中培养)、D组(SGC-7901 干细胞在75 μl 7.5%大鼠四君子汤含药血清中培养)及E组(SGC-7901 干细胞+含有 1 mg/ml的 5-氟尿嘧啶培养基中培养).采用倒置显微镜观察SGC-7901 干细胞形态;比较SGC-7901 细胞及SGC-7901 干细胞及集落形成能力;CCK-8检测各组细胞活性;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;Western印迹检测各组干细胞标志物CD44 及CD133 蛋白,B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Bcl-2 及TFAP4蛋白.结果 SGC-7901 干细胞随着生长周期的延长,球体逐渐增大,3 d时体积较小结构松散,4 d时细胞呈现椭圆形生长,5 d时细胞结构更致密,形态更加接近球形,且一个球体所包含细胞数目可达到数十个;SGC-7901 及SGC-7901 干细胞的细胞集落数组间比较存在显著差异(P＜0.001);与A组相比,B、C、D及E组 24、48、72 及 96 h时SGC-7901 干细胞活性均显著降低(P均＜0.05),与B组相比,C、D、E组上述时间细胞活性显著降低(P＜0.05),与C组相比,D、E组上述时间细胞活性显著降低(P＜0.05),组间比较存在统计学差异(F=112.900,P＜0.001);与A组比较,B组、C组、D组及E组干细胞凋亡率、Bax显著增加,CD44、CD133、Bcl-2及TFAP4 显著降低(P＜0.05).与B组相比,C、D、E组干细胞凋亡率、Bax显著增加,CD44、CD133、Bcl-2 及TFAP4 降低(P＜0.05),与C组相比D、E组有显著意义(P＜0.05).D组与E组上述指标无统计学意义(P＞0.05).结论 四君子汤含药血清可以显著抑制胃癌肿瘤干细胞标志物活性,通过抑制Bcl-2 表达激活Bax加快胃癌干细胞凋亡,研究机制可能与抑制TFAP4 活性相关.

目的探讨转录因子激活增强子结合蛋白4(TFAP 4)在肝细胞癌(HCC)中的表达及其与患者预后的关系.方法标本来源于2007年12月至2014年12月中山大学肿瘤防治中心的116例术后病理检查确诊为HCC患者.患者均签署知情同意书,符合医学伦理学规定.其中男103例,女13例;年龄22～75岁,中位年龄44岁.免疫组化法检测HCC组织TFAP 4的表达量,TFAP 4蛋白表达与临床病理参数之间的关系分析采用χ2检验.生存分析采用Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验.Cox比例风险回归模型分析TFAP 4在HCC组织中的表达与预后的关系.结果TFAP 4高表达者54例,低表达者62例,其表达与患者临床病理参数无相关性(P>0.05).TFAP 4高表达患者的无瘤生存和总体生存均更差(χ2=11.030,4.269;P<0.05).Cox回归分析显示,HBsAg阳性是影响HCC患者无瘤生存的独立危险因素(HR=4.722,95％CI:1.469～19.446,P<0.05),而TFAP 4高表达是影响HCC患者无瘤生存和总体生存的独立危险因素(HR=2.437,2.598;95％CI:1.352～4.394,1.036～6.515;P<0.05).结论TFAP 4高表达是影响HCC患者无瘤生存和总体生存的独立危险因素,TFAP 4高表达患者预后较差.TFAP 4可作为判断HCC患者预后的生物学标志物.

目的 转移和复发是导致非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗失败的主要因素,明确影响转移和复发的相关机制对提高治疗效果及改善患者预后具有重要意义.本研究旨在检测转录因子激活增强子结合蛋白4(transcription factor activating enhancer-binding protein 4,TFAP4)在NSCLC组织中表达,并探讨下调该基因对A549增殖和侵袭的影响.方法 选取2015 03 06-2018 03-04海南省人民医院行手术治疗的NSCLC标本及对应的癌旁组织(距肿瘤边缘≥5 cm)78例,采用免疫组化法检测NSCLC和癌旁组织中TFAP4蛋白表达.细胞实验包括培养NSCLC细胞株,随机分为siRNA TFAP4组(转染TFAP4基因干扰序列)、对照序列组(转染阴性对照序列)和对照组(不作任何处理),通过实时荧光定量聚合酶链反应法(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及蛋白质印迹法检测沉默的效率.四甲基偶氮唑盐(methyl thiazoly tetrazolim,MTT)比色法和Transwell小室分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测细胞中Snail、E-cadherin和Vimentin蛋白表达.结果 NSCLC组织中TFAP4蛋白阳性表达率为79.49％,高于癌旁组织的30.77％,x2 =37.419,P＜0.001;TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(x2=6.395,P＜0.05)、低分化(x2=4.577,P＜0.05)和发生淋巴结转移的NSCLC组织中TFAP4(x2=7.386,P＜0.05)蛋白阳性表达率升高;siRNA TFAP4组细胞中TFAP4 mRNA相对表达量为0.31±0.07,低于对照序列组(0.98±0.13)和对照组(1.00±0.03),F=120.840,P＜0.001;siRNA-TFAP4组迁移细胞数为104.04±3.70,低于对照序列组(133.94±8.20)和对照组(130.98±7.26),F=36.555,P＜0.001;siRNA-TFAP4组侵袭细胞数为96.12±4.36,低于对照序列组(120.31±4.67)和对照组(122.63±5.23),F=56.880,P＜0.001;与对照序列组和对照组比较,24、48、72和96 h siRNA TFAP4组细胞的增殖能力降低,F值分别为9.924、16.429、18.156和16.970,均P＜0.05;siRNA-TFAP4组细胞中TFAP4、Snail和Vimentin蛋白相对表达量低于对照序列组和对照组,F值分别为169.815、34.473和55.089,均P＜0.05,而E-cadherin蛋白相对表达量高于对照序列组和对照组,F=33.780,P＜0.05.结论 TFAP4蛋白在NSCLC组织中呈高表达,下调A549细胞中TFAP4基因表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制上皮-间质转化过程有关.

目的 本实验旨在利用基因芯片技术研究缺氧/复氧(H/R)条件下抑制miR-132表达对缺氧/复氧条件下人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)中基因表达水平的影响.方法 选用HRMEC细胞株,缺氧条件下培养6h,然后再常氧条件下培养6h,作为H/R组;在H/R条件下,添加miR-132的抑拮抗剂(anti-miR-132)作为H/R+ anti-miR-132组;常氧条件下培养的HRMEC为阴性对照组.提取细胞中mRNA,使用mRNA微阵列(HOA 7.1)芯片检测基因表达,然后采用软件包Rosetta Resolver 7.2进行基因本体(G0)分析.结果 ①H/R显著上调CDH13、COL17A1、TNC、MMP14的表达,下调TFAP2C、HPGD、IL18的表达,miR-132是上述表达调控中“必需程度”接近100％的中间执行者;②H/R上调了TCF4、CXCL8、ANGPTI4、PLAT、PLAU、THY1、GPC6、COL5A2和VCAN的表达,下调了CEBPA、DCN、PI3的表达,miR-132是上述表达调控中的中间执行者之一,还存在其他的中间执行者;③通过分子生物功能分析发现IL18、ANGPTL4、PI3与视网膜新生血管(RNV)密切相关,并且COL17A1、MMP14、CXCL8、PLAT、PLAU、THY1、GPC6、VCAN有可能参与RNV.结论 通过基因芯片检测发现miR-132介导了H/R对部分基因的调节,其中部分基因有可能参与RNV的发生、发展,为进一步阐明miR-132调节RNV的机制提供研究基础.