目的:探讨人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)在防治大鼠激素性骨质疏松(GIOP)方面的疗效及其潜在的分子生物学机制。方法:采用光学显微镜、流式细胞技术对HUC-MSCs进行表征和鉴定。成骨细胞MC3T3-E1分为对照组、地塞米松(DEX)组、DEX+不同比例HUC-MSCs组。对照组加入正常培养基，DEX组加入10 μmol/L DEX处理，DEX+不同比例HUC-MSCs组加入10 μmol/L DEX处理细胞，然后将HUC-MSCs按照1∶1、10∶1、100∶1的比例在共培养小室中与MC3T3-E1非接触式共培养48 h。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力。24只SD大鼠随机分成3组( n＝8)：对照组、模型组、治疗组(HUC-MSCs组)。模型组使用DEX构建GIOP模型，对照组给予等量磷酸盐缓冲液(PBS)，治疗组在构建GIOP模型的同时通过尾静脉注射约10 6个HUC-MSCs进行治疗。8周后取股骨组织样本，采用苏木精-伊红(HE)染色观察空骨陷窝率，脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色评价细胞凋亡。进行Micro CT扫描，测量骨密度(BMD)、单位组织体积的骨量(Bv/Tv)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间距(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)等骨质疏松相关指标。提取组织蛋白后，用蛋白印迹法(Western blot)检测通路蛋白表达。两组间比较采用独立样本 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果:流式细胞鉴定结果显示，HUC-MSCs高表达CD44(99.9%)、CD73(98.0%)、CD90(100.0%)、CD105(99.6%)、CD166(99.9%)，低表达CD14(0.43%)、CD19(1.11%)、CD34(0.89%)、CD45(1.06%)、HLA-DR(0.38%)，符合HUC-MSCs表面特异性抗原表达规律。CCK-8显示，模型组较对照组细胞活力明显下降，与HUC-MSCs共培养后可部分恢复MC3T3-E1活力。HE染色对照组、模型组、HUC-MSCs组空骨陷窝率分别为(2.546±1.049)%、(28.720±1.546)%、(13.600±1.012)%。TUNEL染色结果对照组、模型组、HUC-MSCs组TUNEL阳性细胞的比例分别为(2.334±0.789)%、(24.140±4.646)%、(11.610±2.974)%。Micro CT显示模型组BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N均降低，Tb.Sp增加，HUC-MSCs治疗可以一定程度上逆转上述改变。Western blot结果表明，与对照组比较，模型组β-连环蛋白(β-catenin)、Runt相关基因2(Runx2)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)蛋白表达均明显下降，硬化素(SOST)蛋白表达增加，HUC-MSCs治疗组β-catenin、Runx2、BMP-2表达较模型组增加，SOST表达相应减少。结论:HUC-MSCs能够通过Wnt/β-catenin信号通路改善地塞米松所致的骨丢失。

目的:探讨介孔二氧化硅(MSNs)纳米颗粒负载人骨形态发生蛋白-4(BMP-4)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响和作用机制。方法:制备BMP-4@MSNs，扫描电镜观察其形态和表征，计算BMP-4的载药量、包封率和体外缓释率。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测BMSCs增殖能力，茜素红染色检测BMP-4@MSNs对BMSCs的成骨诱导能力，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测BMSCs的相关成骨基因和蛋白表达。组内比较采用One-way ANOVA分析。结果:合成的BMP4@MSNs直径大小为(140.4±1.683) nm，载药量为29.4%，包埋率为84.9%。BMP4@MSNs组细胞增殖高于MSNs组在第3天(1.13±0.07比1.35±0.16， t＝3.545， P<0.05)、第5天(1.39±0.08比1.64±0.07， t＝3.401， P<0.05)、第7天(1.65±0.10比2.11±0.20， t＝5.069， P<0.05)。BMP4@MSNs组的成骨矿化结节茜素红染色深度高于对照组和MSNs组。RT-PCR和Western blot结果提示BMP4@MSNs具有上调成骨相关基因和蛋白(RUNX2、OCN、Osterix)的表达，及上调Wnt/β-连环蛋白(β-Catenin)信号通路相关基因和蛋白(β-Catenin、LRP5)的表达和下调GSK-3β关基因和蛋白的表达。 结论:BMP-4@MSNs通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

目的:探讨氟暴露对小鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖、凋亡及成骨分化的影响。方法:自C57BL/6小鼠（6 ~ 8周）股骨分离、培养得到BMSCs，取第3代细胞采用流式细胞术分析干细胞表面标志物。用氟终浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L的培养基培养BMSCs，检测不同浓度氟对BMSCs细胞增殖（CCK8法）、凋亡（流式细胞术分析）、成骨分化能力[茜素红及碱性磷酸酶（ALP）染色]的影响；采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白[聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）]、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路成员蛋白[细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2），c-Jun氨基末端激酶（JNK），p38及磷酸化ERK、JNK、p38（p-ERK、p-JNK、p-p38）]，成骨分化相关蛋白[Runt相关转录因子2（Runx2）、ALP]与Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路成员蛋白[糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）及β-catenin]的表达水平；并采用免疫荧光染色分析p-GSK3β及β-catenin的表达情况；使用SP600125及DKK-1分别阻断MAPK和Wnt/β-catenin 2个信号通路后，分析细胞凋亡及成骨分化等的变化。结果:成功分离、培养出小鼠BMSCs，流式细胞术分析显示，间充质干细胞表面标志分子CD73、CD90、CD105均呈阳性。各浓度组3个时间点（24、48、72 h）细胞增殖情况比较差异均有统计学意义（ F = 65.36、160.04、365.32， P均< 0.001），各浓度组细胞早期凋亡情况（24 h）比较差异有统计学意义（ F = 214.04， P < 0.001）；与0.0 mg/L氟浓度组比较，15.0、20.0、40.0 mg/L氟浓度组细胞增殖水平均降低，10.0、15.0、20.0 mg/L氟浓度组细胞早期凋亡率均增高（ P均< 0.05）。15.0 mg/L氟处理细胞0 ~ 24 h，p-JNK/JNK比例在2、4、8、12、18、24 h时间点均高于0 min（ P均< 0.05）；与单独氟处理组（15.0 mg/L）比较，SP600125阻断后细胞早期凋亡率降低（ P < 0.05），PARP及p-JNK蛋白表达水平均降低（ P均< 0.05）。成骨诱导后，与0.0 mg/L氟浓度组比较，0.1、1.0 mg/L氟浓度组ALP染色增强、矿化结节数量增多；且0.1、1.0 mg/L氟浓度组Runx2及ALP蛋白表达水平均较高（ P均< 0.05）。成骨诱导后，与0.0 mg/L氟浓度组比较，0.1、1.0 mg/L氟浓度组p-GSK3β/GSK3β比例及β-catenin蛋白表达水平均较高（ P均< 0.05）；与单独氟处理组（1.0 mg/L）比较，DKK-1阻断后p-GSK3β及β-catenin蛋白表达水平均较低（ P均< 0.05），β-catenin入核减少，ALP染色减弱，矿化结节数目减少。 结论:高浓度氟（> 10.0 mg/L）抑制BMSCs增殖、促进凋亡，而低浓度氟（0.1、1.0 mg/L）促进细胞成骨分化。MAPK/JNK通路与Wnt经典通路分别参与了上述细胞过程。

目的:观察激素性股骨头坏死(SONFH)患者来源的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分泌的细胞外囊泡(SONFH-BMSCs-EVs)对正常BMSCs成骨分化的影响。方法:骨髓来源于郑州大学第一附属医院的10例需行髋关节置换术的患者(激素性股骨头坏死5例，非股骨头坏死5例)，提取其中的BMSCs进行培养。采用差速离心法分离SONFH-BMSCs-EVs。将正常BMSCs中加入SONFH-BMSCs-EVs共培养作为实验组，对照组加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)，分别用噻唑蓝(MTT)法，半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3/7活性实验检测SONFH-BMSCs-EVs对BMSCs的增殖、凋亡的影响。取第3代BMSCs进行成骨诱导，诱导过程中实验组加入SONFH-BMSCs-EVs，再进行茜素红染色，检测其对BMSCs成骨分化的影响。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)，蛋白质印迹法(Western blot)检测Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路上成骨相关因子基因、蛋白表达。采用单因素方差分析和 t检验进行统计学分析。 结果:SONFH-BMSCs-EVs为大小不均的圆形膜性囊泡，粒径范围在40~200 nm之间，且表达CD63、CD9标志蛋白。共聚焦显微镜下显示细胞外囊泡可以被BMSCs摄取。MTT法检测BMSCs增殖能力实验组(0.5±0.1)明显低于对照组(1.0， t＝11.160， P<0.01)。Caspase-3/7活性实验检测BMSCs凋亡，实验组(1.4±0.2)明显高于对照组(1.0)，( t＝3.458， P<0.01)。茜素红染色结果显示实验组的红染染色阳性率显著小于对照组。Western blot结果显示Wnt/β-catenin信号通路上关键因子蛋白表达分别为β-catenin(实验组为0.68±0.10，对照组为1.37±0.17， t＝6.960， P<0.01)、Runt相关基因2(Runx2，实验组为0.66±0.13，对照组为1.30±0.16， t＝6.240， P<0.01)，差异均有统计学意义。RT-PCR检测实验组β-catenin、Runx2相对基因表达分别为0.59±0.12、0.66±0.08，差异有统计学意义( t＝6.960、6.240， P均<0.01)。 结论:激素性股骨头坏死患者来源的BMSCs分泌的细胞外囊泡可以抑制正常BMSCs增殖及成骨分化。

目的:探讨激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨成脂分化功能机制，检测经典Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路中关键因子的表达差异。方法:从预行全髋关节置换术的4例激素性股骨头坏死患者和4例非股骨头坏死患者的骨髓液中提取骨髓间充质干细胞，分别设为实验组和对照组，应用噻唑蓝(MTT)法、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3/Caspase7活性细胞凋亡检测及活细胞和死细胞试验评估激素对BM-MSCs增殖和凋亡的影响。取第3代细胞成骨诱导后进行茜素红染色及成脂诱导后油红O染色，检测激素对BMSCs成骨成脂分化的影响。蛋白质印迹法(Western blot)和实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测经典Wnt/β-catenin信号通路中关键因子的表达，采用单因素方差分析和 t检验比较各组间差异。 结果:激素性股骨头坏死组MTT法BMSCs增殖能力低于对照组(0.7±0.2比1.0， P<0.01)，差异有统计学意义。Caspase 3/7活性细胞凋亡检测激素性股骨头坏死组BMSCs凋亡高于对照组(1.3±0.2比1.0， P<0.05)。活细胞试验，激素性股骨头坏死组BMSCs活细胞数少于对照组(414.3±26.3比600.0±79.3， P<0.01)。死细胞试验激素性股骨头坏死组BMSCs死细胞数多于对照组(139.3±23.0比25.7±6.8， P<0.01)。成骨诱导后茜素红染色，实验组红染面积明显小于对照组。成脂诱导后行油红O染色，实验组红染脂滴数量明显多于对照组。Western blot检测激素性股骨头坏死中关键因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)蛋白表达升高(1.35±0.23)；Runt相关基因2(RUNX2)、Wnt5a/b、β-Catenin蛋白表达降低，分别为0.58±0.11、0.69±0.22、0.66±0.11。实时定量PCR检测BMP2、RUNX2、Collagen Ⅰ mRNA表达降低，分别为0.73±0.16、0.57±0.17、0.48±0.26；PPARG mRNA表达升高(1.48±0.32， P<0.01)，差异均有统计学意义。 结论:激素性股骨头坏死是由于经典Wnt/β-catenin信号通路被抑制导致骨髓间充质干细胞增殖能力下降及成骨成脂分化平衡紊乱。

目的:观察川续断皂苷Ⅵ对胫骨骨折模型大鼠骨折的修复作用及其可能机制。方法:30只SD大鼠经锯开法建立胫骨骨折大鼠模型，随机分为模型组、干预组、联合组，每组各10只。术后第2天模型组每天腹腔注射生理盐水、DMSO溶液各0.2 ml；干预组每天腹腔注射川续断皂苷Ⅵ生理盐水溶液0.2 ml(10 mg/kg)，DMSO溶液0.2 ml；联合组每天腹腔注射川续断皂苷Ⅵ生理盐水溶液0.2 ml(10 mg/kg)，XAV939 DMSO溶液0.2 ml(1 mg/只)，均连续干预14 d。干预后2、4周采用Micro-CT扫描、X线片扫描观察骨折愈合情况；干预后4周检测胫骨湿重；苏木素-伊红(HE)染色观察骨痂组织病理学改变；Western blot法检测骨痂组织β-连环蛋白(β-catenin)、p-β-catenin、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、Runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达量。结果:干预组干预后2、4周骨体积分数(BV/TV)及骨小梁数量(Tb.N)、Lane-Sandhu评分、骨痂体积均高于模型组(均 P<0.05)；联合组干预后2、4周BV/TV及Tb.N、Lane-Sandhu评分、骨痂体积均低于干预组(均 P<0.05)。干预组干预后4周胫骨湿重高于模型组( P<0.05)；联合组胫骨湿重低于干预组( P<0.05)。HE染色结果显示，模型组有纤维组织增生，较多骨小梁生成，但成熟度不高、增粗不明显；干预组形成较多骨性骨痂，骨小梁排列有序、部分成熟，且矿化明显，与应力方向一致；联合组形成较多软骨性及纤维性骨痂，软骨性骨痂边缘矿化较多，并形成骨小梁，在间隙中可观察到丰富的毛细血管。干预组骨痂组织中Runx2及p-β-catenin/β-catenin蛋白表达量高于模型组，GSK-3β蛋白表达量低于模型组(均 P<0.05)；联合组骨痂组织中Runx2及p-β-catenin/β-catenin蛋白表达量低于干预组，GSK-3β蛋白表达量高于干预组(均 P<0.05)。 结论:川续断皂苷Ⅵ可有效促进胫骨骨折模型大鼠骨折修复，可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路来发挥作用。

研究发现Runx2在骨质疏松症(osteoporosis,OP)的发生发展过程中起到重要作用.Runx2通过结合特定的DNA序列来调节许多基因的转录,与骨代谢的关系密切,可通过多个信号通路、细胞因子、激素等对成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞等具有调控作用.近年来,中医药在防治骨质疏松方面的研究越来越多,许多学者发现在骨质疏松症的治疗中补肾类中药与Runx2因子存在明显的相关性,如单药中的淫羊藿、骨碎补、杜仲、鹿茸、补骨脂,复方中的六味地黄丸、左归丸、补肾活血汤、二仙汤、仙灵骨葆胶囊,可通过作用于不同的信号通路,如Wnt/β-catenin、BMPs、MAPK、PI3K/AKT、Hedgehog等信号通路调控Runx2的表达以防治骨质疏松.故该文通过补肾类中药对Runx2因子调控相关信号通路防治骨质疏松症进行综述,以期为中药防治骨质疏松症的相关研究提供参考.

目的 探究Osteonectin在促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的分子机制,以及Osteonectin在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用.方法 将2020 年5 月—2022 年5 月就诊的20 例AIS及健康体检20 例分别作为AIS组和健康组.使用qRT-PCR技术测定2 组BMSCs中Osteonectin、BMP2 以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因(Tcf7、Lef1)和成骨分化相关基因(Runx2、Osteocalcin)的表达水平.通过X线检测AIS患者的Cobb角度,并分析上述基因表达水平与Cobb角度的相关性.在BMSCs中,加入Osteonectin和BMP2 抑制剂Noggin,并分为对照组、Osteonec-tin组和Osteonectin +Noggin组.通过qRT-PCR检测BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2 和Osteocalcin mRNA表达水平.采用ChIP-qPCR检测β-catenin在Runx2 和Osteocalcin基因转录起始位(TSS)的富集水平.结果 与健康组比较,AIS组BMSCs中Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2 和Osteocalcin mRNA表达水平均降低(P<0.05);Osteonec-tin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2 和Osteocalcin mRNA表达水平与AIS患者Cobb角度呈负相关(r =-0.466 3、-0.369 1、-0.272 7、-0.543 4、-0.606 5、-0.343 3,P<0.05,P<0.01).与对照组比较,Osteonectin组BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2 和Osteocalcin mRNA表达水平升高,且β-catenin在Runx2 和Osteocalcin mRNA TSS富集水平增加(P<0.05).相比Osteonectin组,Osteonectin + Noggin组BMSCs中Tcf7、Lef1、Runx2 和Osteocalcin mRNA表达水平降低,β-catenin在Runx2 和Osteocalcin mRNA TSS富集水平降低(P<0.05).结论 在AIS患者中,BMSCs中Osteonectin、BMP2-Wnt/β-catenin的表达以及成骨分化水平与 AIS 疾病的发展呈负相关.Osteonectin 通过激活 BMP2-Wnt/β-catenin信号通路,促使β-catenin转录激活成骨分化相关基因,从而促进BMSCs的成骨分化.

目的:探讨蓬松蛋白(DVL)DNA甲基化对骨质疏松(OP)患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化及Wnt通路的影响.方法:分离、培养OP患者的BMSCs,成骨诱导培养BMSCs 0、7、14、21天,观察BMSCs细胞形态变化,检测碱性磷酸酶(ALP)染色及活性,检测茜素红染色及钙结节形成,荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)及免疫印迹检测远端缺失同源盒5(Dlx5)、核心结合蛋白因子2(Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、Ⅰ型胶原蛋白(Colla Ⅰ)表达.检测DVL1、Wnt、糖原合成酶激酶3(GSK3)、β连环蛋白(β-catenin)表达及DVLDNA甲基化水平.在成骨诱导培养基中加入甲基转移酶抑制剂5-Aza,将BMSCs分为对照组(Control组)、甲基转移酶抑制剂组(5-Aza组)、甲基转移酶抑制剂+si-NC组(5-Aza+si-NC组)、甲基转移酶抑制剂+si-Wnt组(5-Aza+si-Wnt组),依次进行ALP活性测定,茜素红染色及钙结节形成测定.RT-PCR检测Dlx5、Runx2、OSX、Colla 1水平,免疫印迹检测Dlx5、Runx2、OSX、Colla Ⅰ、DVL1、Wnt、GSK3、β-catenin的蛋白表达量,并检测DVLDNA甲基化水平.结果:成骨诱导后BMSCs具有强的ALP活性和矿化结节生成能力,且随着培养时间的增长,BMSCs细胞ALP活性和矿化结节生成能力增强,Dlx5、Runx2、OSX、Colla Ⅰ mRNA 水平和 Wnt、GSK3、β-catenin、DVL 1 表达升高,DVL DNA 甲基化水平降低(P＜0.05). 5-Aza组较Contro l组ALP染色加深,活性增强,钙结节形成增多(P＜0.05),Dlx5、Runx2、OSX、Colla Ⅰ mRNA及蛋白表达、Wnt、GSK3、β-catenin、DVL1 表达升高,DVLDNA 甲基化水平降低(P＜0.05).5-Aza+si-Wnt 组较5-Aza+si-NC 组 ALP 染色变浅,活性降低,钙结节形成减少(P＜0.05),Dlx5、Runx2、OSX、Colla Ⅰ mRNA及蛋白表达、Wnt、GSK3、β-catenin、DVL1表达降低,DVLDNA甲基化水平升高(P＜0.05).结论:DVLDNA甲基化可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制OP患者BMSCs成骨分化.

目的:探讨配体WNT3A通过稳定和激活FZD2(Frizzled2)增加成骨细胞骨形成的活性及其分子机制.方法:24 只雌性6～8 周龄C57BL/6J小鼠随机分为4 组,对照(Control)组,假手术(Sham)组,双侧卵巢摘除术(ovariectomy,OVX)诱导骨质疏松症(Osteoporosis,OP)小鼠模型组(OVX 组),OVX +雌二醇治疗组(OVX+E2 Treatment组),每组6 只小鼠.建立OVX小鼠模型.Western blot法测定小鼠后肢胫骨组织中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP 和 Runx2 以及磷酸化(p-)STAT3、STAT3、p-JAK2 和JAK2 的表达水平.CCK-8 测定小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1 的增殖能力.腺病毒-shRNA-FZD2 介导敲低MC3T3-E1 细胞中的FZD2.免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation,co-IP)法测定WNT3A处理MC3T3-E1 细胞前后FZD2 与泛素(ubiquitin,Ub)的直接结合情况.结果:与OVX组相比,OVX+E2 Treatment组小鼠胫骨组织中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP 和Runx2 的表达水平均被上调(P<0.05).与Control组相比,WNT3A Treatment组MC3T3-E1 细胞中 FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP 和Runx2 的表达水平均升高(P<0.05);细胞增殖能力增强(P<0.05).与WNT3A Treatment组相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2 组FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP 和Runx2 的表达水平均降低(P<0.05);p-STAT3 和p-JAK2 的磷酸化水平均降低(P<0.05);增殖能力降低(P<0.05);而2 组细胞中STAT3 和JAK2 的表达水平无统计学差异(P>0.05).在 IP:Ub 组中,与WNT3A 处理(-)的细胞相比,WNT3A 处理(+)的细胞中 FZD2 的表达水平升高(P<0.05).结论:WNT3A的促骨合成代谢活性是通过结合并稳定FZD2 激活Wnt/β-Catenin信号通路实现的.