多不饱和脂肪酸属直链脂肪酸,是机体生物膜的关键结构组分,它可以调控糖脂代谢及激素代谢,具有促进发育、提高免疫力和预防疾病等多种益生功能,对机体健康具有十分重要的作用.因此,多不饱和脂肪酸在食品、医药和饲料等多个领域均表现出重要的应用价值和广阔的开发前景,市场需求持续上升.与传统的海洋生物提取法相比,微生物合成法具有生产周期短、工艺简单、对环境友好等优势,近年来利用微生物细胞工厂生产多不饱和脂肪酸等微生物油脂逐渐成为科学界和工业界的研究热点和发展趋势.解脂耶氏酵母作为一种非常规产油酵母,因其具备高产油脂和脂肪酸的天然能力,因此成为了代谢工程改造微生物生产多不饱和脂肪酸的首选底盘细胞之一.本文首先介绍了多不饱和脂肪酸的来源及其天然合成途径;然后总结归纳了当前利用代谢工程策略改造解脂耶氏酵母生产多不饱和脂肪酸的研究现状;最后对利用解脂耶氏酵母细胞工厂生产多不饱和脂肪酸存在的主要瓶颈问题和未来发展趋势进行了探讨,期望为未来高效合成多不饱和脂肪酸微生物细胞工厂的构建提供理论支持与思路.

目的:人工区室化是代谢工程及合成生物学的重要技术手段,针对脂滴区室化技术未得到有效评价的现状,以产油微生物红法夫酵母为检验体系,评价筛选脂滴定位信号 方法:基于芝麻油质蛋白oleosin的三维结构及其跨膜结构域分析,设计短序列脂滴定位信号,构建定位信号与eGFP荧光蛋白基因融合的表达载体,转化红法夫酵母,采用荧光显微观察评价定位信号的定位功能.结果:完整的oleosin蛋白Olsl(1-145)和肽段Ols2(1-63)、Ols4(32-63)、Ols5(44-63)均能引导eGFP定位于红法夫酵母的脂滴内部,肽段Ols3(64-145)不能有效引导eGFP定位于脂滴,仅在细胞质中游离表达.结论:筛选得到了一个短序列脂滴定位信号Ols5(44-63),其仅含19个氨基酸,能够有效引导eGFP定位于脂滴内部.

为提高资源利用效率,降低微生物油脂发酵成本,解决微生物油脂发酵中废弃酵母细胞和发酵废液处理排放的问题,研究隐球酵母(Cryptococcus podzolicus)Zwy-2-3利用栎类淀粉发酵产油情况,并探讨发酵废液和废弃酵母细胞酶解液作为氮源的循环利用.结果显示,以葡萄糖60 g/L和总氮0.18 g/L的废弃酵母细胞酶解液发酵时,循环3次其油脂产量分别达到6.79 g/L、6.66 g/L、6.72 g/L,均高于对照组;而将发酵废液回收用作废弃酵母细胞酶解的缓冲液时,其生物量、油脂产量同对照组相当;将该方法应用于栎类淀粉水解液同步糖化发酵产油脂的实验,循环3次后其生物量、油脂产量分别为13.04 g/L、7.13 g/L,比对照组提高了9.85％、10.03％,且3次循环的油脂含量较为稳定.油脂组分分析结果显示,菌株Zwy-2-3利用栎类淀粉同步糖化和废弃细胞循环酶解液发酵生产的微生物油脂不饱和脂肪酸的含量达到93％以上,与植物油组成相似.综上,酶解废弃酵母细胞可有效应用于酵母产油发酵,可为非粮淀粉生产的微生物油脂应用于生物柴油生产奠定基础.

对粘性丝胞酵母进行紫外诱变,获得一株产油率较高的菌株,较原菌株提高了1.53倍.将该菌株接种于用1％硫酸和酶水解处理并浓缩至还原糖浓度为5％的玉米秸秆水解液中培养,生长较好.通过四因素三水平正交实验,确定培养条件为初始pH值7.0、接种量1％、发酵温度30℃、发酵时间5d时产油率最高.对最佳产油条件进行验证,测得油脂含量为21.3％.从而为利用农业废弃物大规模生产微生物油脂提供了试验数据.气相色谱-质谱联用分析仪显示油脂脂肪酸组成为棕榈酸28.36％,油酸55.86％,10-十八烯酸9.23％,硬脂酸6.70％,可以作为原料生产生物柴油.

目的 用斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)作为发酵菌株,以纯木糖溶液为油脂发酵原料,对L.starkeyi利用木糖积累油脂进行系统研究.方法 L.starkeyi于斜面培养基中活化后,接种于YPD液体培养基,于30℃、200 r/min摇床培养.在摇瓶中培养一段时间后,测定发酵液细胞浓度,离心发酵液收集细胞.将离心后得到的菌体加入木糖溶液重悬,并转接于含50 mL木糖溶液的250 mL摇瓶中进行发酵生产.结果 相比一阶段法,两阶段发酵方法可以在更短的时间内达到较高的油脂含量,油脂含量能够达到细胞自身干重的60％以上.实验发现高菌龄酵母产油速度更快;并且初始木糖浓度高达120 g/L时,酵母细胞仍然能够高效合成油脂.结论 L.starkeyi能够有效利用木糖进行发酵产生油脂,是以木质纤维素为原料生产微生物油脂的优良菌种.

[背景]解脂耶罗维亚酵母属于产油微生物,大量研究表明该酵母能够高产长链脂肪酸和油脂,但是应用该酵母合成超长链脂肪酸仍待研究.[目的]工程化解脂耶罗维亚酵母合成高值超长链脂肪酸,并研究温度对脂肪酸合成的影响.[方法]合成密码子优化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)延长酶基因AtFAE1、非洲芥菜(Brassica tournefortii)延长酶基因BtFAE1和碎米芥属植物Cardaminegraeca的延长酶基因CgKCS,分别构建质粒pYLEX1-AtFAE1、pYLEX1-BtFAE1、pYLEX1-CgKCS和pYLEX1-AtFAE1-BtFAE 1-CgKCS.以解脂耶罗维亚酵母菌株Po1g为宿主,通过化学法分别转化上述4个质粒,获得工程菌Po1g-AtFAE1、Po1g-BtFAE1、Po1g-CgKCS和Po1g-AtFAE1-BtFAE1-CgKCS,比较评价超长链脂肪酸的合成.在此基础上,过表达内源二酯酰甘油酰基转移酶基因DGAT1(diacylglycerol acyltransferase)提高产油量,并研究温度对生物量、产油、脂肪酸组成的影响.[结果]在解脂耶罗维亚酵母中3个延长酶的延长能力明显不同,AtFAE1主要催化C20∶1脂肪酸的合成,BtFAE1更有利于芥酸(C22∶1)的合成,而CgKCS能够催化合成神经酸(C24∶1),但是三者共表达并未提高神经酸产量.在表达CgKCS基因的菌株中过表达DGAT1基因,细胞油脂含量提高50％.温度实验表明,低温有利于解脂耶罗维亚酵母合成不饱和脂肪酸,反之,高温利于其合成饱和脂肪酸.[结论]脂肪酸延长酶基因CgKCS可直接催化C18∶1脂肪酸合成C24∶1的超长链脂肪酸,并且通过优化培养温度可提高不饱和脂肪酸的合成.本研究为构建超长链脂肪酸细胞工厂以及发酵优化提供理论和技术参考.

当前能源系统正在从化石能源绝对主导向低碳多能融合方向转变.微生物油脂是一种新兴的油料资源,可应用于能源、食品和化工等多个领域.产油酵母由于具备培养简单、生物量大、油脂含量高、底物利用谱广以及工业化生产中适应性强等优点,近年来受到极大关注.本文中,笔者全面分析了国内外利用酵母生产油脂的研究现状,主要包括油脂合成机制解析、油脂生产过程强化、廉价生物质资源的拓展以及附加值产品联产体系的建立,同时概括了微生物油脂技术产业化面临的问题及其解决方案,最后指出了微生物油脂研究的未来发展方向.

清洁可再生能源生物柴油的开发利用是对当今能源短缺环境下化石燃料替代物的有益探索.微生物油脂作为一种可能实现生物柴油廉价、高效生产的原料引起了广泛的关注,但由于封闭式培养模式操作复杂、成本高制约了其大规模应用.美极梅奇酵母Metschnikowia pulcherrmia是一种新型产油酵母,具有适应性强、底物利用范围广、可在开放体系培养等特点,很有潜力代替传统产油微生物,实现基于生物柴油的废水及固废能源化工程应用.文中对美极梅奇酵母相关研究开展了全面调研,在分析其产油研究及应用现状的基础上,总结了美极梅奇酵母在油脂生产方面所具有的独特优势和关键影响因素,突出强调了其在开放体系培养及利用有机废弃物生产微生物油脂的可行性.此外,文中还指出了美极梅奇酵母在油脂产量、产油机理等方面存在的问题与不足,为实现生物柴油高效生产提供了新的方向和思路,有利于进一步促进其工业化应用.

对产油皮状丝孢酵母进行常压室温等离子体(ARTP)诱变,筛选得到一株高产菌株A1.为了进一步研究高产菌株A1的基因表达和代谢通路的变化,利用转录组测序手段,对原始菌株WT和高产菌株A1进行发酵培养至油脂积累最大值时,然后进行转录组测序分析.结果表明:A1与WT相比,有1 185个显著基因差异表达,其中767个基因表达上调,418个基因表达下调;利用差异基因GO富集分析发现,与细胞过程、代谢过程、催化活性、细胞部分等相关的基因表现出富集;在KEEG代谢通路中,差异基因主要涉及酵母细胞周期、基因复制、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、糖酵解/糖异生等过程.研究发现3个与脂肪酸积累相关的酶过表达,分别为柠檬酸合成酶、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶.这些结果可为后期的油脂酵母基因改造和代谢通路调控提供理论依据.

[背景]乙酰辅酶A乙酰基转移酶(Acetyl Coenzyme A Acyltransferase,Acat)是硫解酶家族的一员,分为Ⅰ型和Ⅱ型,而Ⅱ型作为甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径的第一个限速酶,其表达水平和催化活性会影响萜类及其衍生物的合成量.[目的]分析Acat Ⅱ型基因的过表达对红冬孢酵母产类胡萝卜素的影响.[方法]从红冬孢酵母YM25235菌株中克隆编码Acat Ⅱ型的基因RKAcat2,将其回转到红冬孢酵母YM25235菌株中,构建一株RKAcat2基因过表达菌株进行分析.[结果]与对照菌株相比,RKAcat2基因过表达使YM25235菌株中类胡萝卜素含量提高了50.53％,而菌株中油脂含量降低了22.80％,脂肪酸组成中油酸含量显著下降了17.78％,而且菌株中乙酰辅酶A(Coenzyme A,CoA)的含量也下降了13.64％.[结论]过表达RKAcat2基因促进更多乙酰CoA进入MVA途径中,从而提高了类胡萝卜素的合成水平,这与部分MVA途径和类胡萝卜素合成途径中基因的转录分析结果一致.研究结果可为进一步通过代谢工程手段提高产油红酵母中类胡萝卜素及其特定组分含量的研究提供参考.