目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤，酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性，流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能，Fortebio测定抗体亲和力，抗体全长测序，经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)；人EGFR单克隆抗体杂交瘤系，经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因，构建scFv，克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接，克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体，使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞，获得包装病毒，感染293V细胞，FACS测定CAR膜表达，ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况，转染激活人外周血T细胞，验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3，具备高度配受体封阻性能，经人源化改造后，亲和力稳定(2.67×10 －10 mol/L)，EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2)，其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后，细胞膜表面表达EGFR-scFv，检测培养上清存在PD-L1-ScFv；CTZ0431-2感染293V细胞后，细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达，双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体，EGFR-CAR中度结合亲和力，此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。

目的 制备抗髓系细胞触发受体 2(TREM2)抗体并初步探究其生物学活性.方法 采用杂交瘤筛选的方法,获得稳定分泌抗TREM2 抗体的杂交瘤细胞株,并对杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行筛选,选择结合效果最佳的单克隆抗体进行人源化改造得到嵌合抗体;对嵌合抗体进行进一步的人源化改造,采用酶联免疫吸附法(ELISA)及流式细胞术(FACS)检测人源化抗体的抗原抗体结合活性;采用生物膜干涉技术(BLI)检测人源化抗体与人TREM2结合动力学;通过基于报告基因的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)生物学活性测定方法,检测人源化抗体的依赖细胞介导的细胞毒效应;使用免疫缺陷小鼠对人源化抗体进行体内药效实验.结果 利用杂交瘤技术成功筛选到稳定表达抗TREM2 抗体的杂交瘤细胞株,对杂交瘤细胞株进行进一步人源化改造,获得纯度高于 95%的人源化抗体h7B6-11,抗体h7B6-11 与TREM2-His蛋白具有高度亲和性,且对 293T-TREM2 细胞的ADCC活性明显强于对照抗体.体内药效实验结果显示,h7B6-11 与程序性死亡受体 1(PD1)抗体联合用药抑制肿瘤生长效果明显.结论 抗体h7B6-11具有高度亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为新一代肿瘤免疫治疗的抗体药物.

细胞免疫治疗是针对自身免疫细胞能力低下的恶性肿瘤患者进行的一种新型补充疗法,包括基于T细胞的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)疗法,基于NK细胞的嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)疗法和自体细胞免疫疗法(CIK),还有基于其他免疫细胞如单核吞噬细胞,包括树突状细胞和巨噬细胞的输注治疗.其中,自然杀伤细胞(nature killer cell,NK细胞)作为机体天然免疫的重要细胞,在机体抗肿瘤、抗病毒感染、免疫调节中发挥着重要作用.它可以像T细胞一样通过工程化改造后靶向治疗肿瘤,还能够进行同种异体来源的NK细胞输注治疗,弥补了 T细胞自体来源受限和异体免疫排斥的缺点.研究证实,输注异体NK细胞的患者不会发生严重的移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD).NK细胞不仅扩大了用于细胞免疫治疗的细胞种类,还为形成较低成本的细胞免疫治疗产品提供了广阔应用前景.但是目前仍存在NK细胞质量不稳定,制备流程缺乏统一质量标准等问题,虽有部分NK细胞免疫治疗产品已经获得了美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA))或国家药品监督管理局(National Medical Products Administration,NMPA)的批准,但仍然没有明确公开的NK细胞免疫治疗产品的规范生产体系.本文从NK细胞独特的免疫调节作用机制出发,综合近年研究者利用NK细胞在恶性肿瘤治疗上应用的治疗策略和临床前研究及临床试验的最新进展,最终落脚于NK细胞的体外扩增办法及活性功能维持的研究进展上,表明NK细胞有望形成质量统一的细胞免疫治疗产品.

目的:通过对CAR结构的ScFv单链可变区进行改造,构建并筛选具有更强杀伤肿瘤细胞功能的新型靶向人源B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞.方法:构建靶向人源BCMA的CAR分子,用逆转录病毒载体包装成功后转导健康志愿者的T细胞,制备Anti-BCMA-CAR-T细胞.将Anti-BCMA-CAR-T细胞作为观察组,普通T细胞作为对照组,将其与RP-MI-8226细胞共培养,采用CFSE染色的T细胞增殖实验观察两组体外增殖能力.采用荧光素酶化学发光实验检测两组细胞在不同效靶比(1∶8、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1)对RPMI-8226细胞的杀伤效率,采用流式细胞术检测两组细胞在不同效靶比(1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1)对RPMI-8226细胞的杀伤效率.结果:CFSE检测结果显示,与对照组比较,观察组FITC信号明显左移,表明T细胞增殖能力越强.流式细胞术检测结果显示,相同效靶比时,观察组对RPMI-8226细胞的杀伤效率均高于对照组(P均＜0.05);荧光素酶化学发光实验结果显示,相同效靶比时,观察组对RPMI-8226细胞的杀伤效率均高于对照组(P均＜0.05).在效靶比为4∶1时,CAR170-T(未经改造的传统的ScFv)细胞和CAR174-T(经改造的ScFv)细胞的杀伤效率分别达到了 88.5±0.3％和98.5±0.7％.结论:通过对CAR结构的ScFv单链可变区进行改造后成功构建出的新型靶向BCMA的CAR-T细胞,它能保持较强的增殖活性且具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力.

实验动物模型一直是支撑医药研究的重要工具,作为人类的生物学替代物,已经被广泛用来探究多种人类疾病的发生、发展,并验证治疗效果,很多重要的研究成果均来源于建立的各种各样的实验动物模型.但是,因为种属差异的存在,实验动物与人类在生理结构,功能,及病理变化等方面均存在许多差异,即便是非人灵长类或者基因改造鼠,仍然无法再现人类一些非常重要的特点.绝大多数人类病原微生物无法感染实验动物或者在实验动物上有着完全不同的临床表现,并且对于许多外源性物质的代谢也存在着显著的差异,这使得实验结果不能完全准确的推导到人体,给人类医药研究带来许多不便.

目的 构建人源化抗CD19嵌合抗原受体T细胞(CAR-T),通过体外实验验证其杀伤白血病细胞的能力.方法 将人CD19的鼠源抗体(FMC63)进行了人源化改造,获得高亲和力的人源化CD19抗体;构建携带人源化CD19 CAR慢病毒载体,感染T细胞获得人源化CD19 CAR-T细胞(hCART19);按不同效靶比将效应细胞[hCART19、未转染的T细胞(阴性组)及对照病毒转染的T细胞(对照组)]及靶细胞(CHO-K1-CD19及Raji细胞)混合培养,LDH释放实验及ELISA法检测hCART 19杀伤白血病细胞的能力及细胞因子释放水平;白血病小鼠模型检测hCART 19的杀瘤效果.结果 LDH释放实验证实随着效靶比的不断增加,对靶细胞的杀伤率逐渐增加,当效靶比为10∶1时hCART19组的杀伤率最大,在Raji细胞中为(87.56±1.99)％,明显高于阴性组[(19.31±1.16)％]及对照组[(21.35±1.19)％](P值均＜0.001).ELISA法检测显示Raji细胞作为靶细胞时,hCART 19组IL-2水平[(10.56±0.88)pg/ml]及IFN-γ[(199.02±12.66)pg/ml]较阴性组[IL-2:(3.55±0.26)pg/ml;IFN-γ:(37.63±0.85)pg/ml]及对照组[IL-2:(2.92±0.32)pg/ml;IFN-γ:(52.07±3.33)pg/ml]明显升高(P值均＜0.001).以上实验在CHO-K 1-CD 19细胞作为靶细胞时也出现了相似的结果.给予白血病小鼠模型尾静脉分别注射hCART 19、对照病毒转染的T细胞及未转染的T细胞,结果显示hCART 19组小鼠存活时间＞40 d,另外两组小鼠在20～ 30 d全部死亡,差异有统计学意义(x2=11.73,P=0.008).结论 成功构建了具有抗白血病活性的人源化CD19 CAR-T细胞,为下一步的临床研究奠定了基础.

[目的]多肽化合物Surugamides (sgm)生物合成基因簇包含4个非核糖体多肽合酶(NRPS)基因surA-D,负责2个NRPS生物合成途径.已有报道确认surA基因与Surugamide A产物相关,而surB基因与sgm F产物相关,但对surC和surD基因功能的归属尚没有实验证据.本工作拟在之前研究的基础上进一步确认surA和surD负责Surugamide A产物生物合成,为基因工程改造Surugamides生物合成途径以及研究其NRPS蛋白之间的识别机制提供理论依据.[方法]从海绵中分离放线菌并通过16SrRNA基因序列比对分析其分类单元.通过在线数据库antiSMASH分析基因组序列,发现天然产物生物合成基因簇.通过UPLC-Q-TOF-MS和13C NMR鉴定化合物结构.把构建完成的同源重组双交换质粒导入链霉菌宿主后筛选基因缺失或替换突变株.[结果]从胄甲海绵来源链霉菌S.albidoflavus LHW3101基因组中发现了Surugamides生物合成基因簇,确认了该菌株发酵产物中的化合物sgm A和sgm F.构建了surB和surC基因同时缺失的突变株RJ9,发现RJ9不再产sgm F而仍然产Surugamide A.在缺失突变surB和surC基因的同时在surD基因前引入了组成型强启动子ermEp*,结果发现R J9产Surugamide A水平是野生型菌株的约2倍.[结论]确认了surB和surC基因与sgm A产物无关.在surD基因前引入强启动子后显著提高了Surugamide A的产量,提示surD基因与sgm A产物相关,结合已报到surA基因与Surugamide A产物相关的证据,进一步确认了surA和surD基因负责Surugamide A生物合成的推论.

多发性骨髓瘤被认为是一种无法治愈的血液系统恶性疾病,其特征为恶性浆细胞的克隆性增殖.尽管在过去的几十年中,自体干细胞移植(ASCT)的应用及新型药物(蛋白酶体抑制剂和免疫调节药)的问世,将患者的中位生存时间由原来的4年提高到了8年,但复发与难治仍然是多发性骨髓瘤疾病进程中难以逾越的鸿沟.为了获得长期持续的缓解,免疫治疗开始在多发性骨髓瘤中崭露头角,其中嵌合抗原受体(CAR) T细胞治疗就是最有潜力的一颗新星.通过在基因层面改造患者自己的T细胞,使T细胞表达一种特定的受体(人造的融合蛋白),该受体可以识别并结合肿瘤相关抗原,并活化T细胞启动后续的杀伤过程.Tisagenlecleucel和Axicabtagene是两个针对CD19抗原的CAR T产品,用于治疗B细胞来源的急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL),并于2017年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准.这两个产品的发展极大推动了B细胞来源的恶性血液系统疾病的治疗,并刷新了对于传统治疗的认知.基于之前CAR T治疗的成功经验,寻找如CD19一样的特定靶点能为CAR T治疗多发性骨髓瘤打下基础.本综述介绍了数个在骨髓瘤细胞上的肿瘤靶抗原,如B细胞成熟抗原(BCMA)和CD38.这些针对抗原的CAR T治疗有些还在实验室阶段,而有些已经进入了3期的临床试验,很有可能成为下一个被批准的CAR T产品.另外,本综述也介绍了在CAR T治疗中出现的毒副反应以及相应的管理和处理方法.

羊毛硫肽(lanthipeptide)是由核糖体合成并经翻译后修饰产生的肽类天然产物,具有丰富的分子结构和多样的生物活性.新型羊毛硫肽是活性药物的重要来源,可以通过基因组挖掘和工程改造获得.羊毛硫肽前体肽由基因编码,同时其合成酶具有较高的底物杂泛性.基于这些特征,可以对羊毛硫肽的生物合成过程开展高通量工程改造,从而快速获得新的羊毛硫肽衍生物.综述了近些年高通量构建和筛选羊毛硫肽衍生物的新方法:介绍了非天然氨基酸引入、组合式生物合成、嵌合前导肽等文库构建技术;讨论了细胞表面展示、反向双杂交、细胞自裂解、无细胞(cell-free)体系等方法在结构与活性筛选中的应用;对基于自动化合成生物技术开展羊毛硫肽的规模化工程改造进行了展望.

患者自身T细胞经过嵌合抗原受体(CAR)基因修饰后,不再受主要组织相容性复合物限制,因而可实现对肿瘤靶标高效应答.目前CAR-T细胞治疗已在部分血液系统恶性肿瘤中显示出了较好的疗效,但在实体瘤中的疗效却差强人意,其主要原因包括实体瘤缺乏特异性强的抗原靶标、经过基因工程改造后的T细胞归巢能力不确定以及抑制性肿瘤免疫微环境.临床试验中,研究较多的实体瘤CAR-T细胞治疗靶点有双唾液酸神经节苷脂(GD2)、紧密连接蛋白18亚型2(CLDN18.2)、间皮素、B7同源性3(B7H3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)3、表皮生长因子受体变异体(EGFRv)Ⅲ等.CAR-T细胞与溶瘤病毒、酪氨酸激酶抑制剂、程序性死亡蛋白-1单抗等联合治疗可增加其疗效.本文总结了针对CAR-T细胞治疗实体瘤的优化策略,如通过基因编辑增强其活性;添加相应元件的调控使CAR-T细胞的激活更加安全可控;增强CAR-T细胞的持久性等.通过综述CAR-T细胞治疗实体瘤的最新研究进展,以期为实体瘤的临床治疗提供新思路.