目的:研究靶向CD33抗原双特异性及三特异性T细胞衔接器对T细胞增殖及其抗白血病作用。方法:构建抗CD33scFv-抗CD3scFv的双特异性T细胞衔接器（CD33-BiTE）及在BiTE基础上加入CD80胞外段的三特异性T细胞衔接器（CD33-TriTE）表达载体，使用真核细胞表达系统表达蛋白并进行亲和层析纯化。检测CD33-BiTE及CD33-TriTE对T细胞活化增殖功能及对白血病细胞杀伤功能活性的影响。结果:①成功构建了CD33-BiTE及CD33-TriTE表达载体，在真核细胞中表达，纯化得到的融合蛋白能与相同靶抗原流式抗体竞争结合于靶细胞表面。②CD33-BiTE及CD33-TriTE分别与人T细胞共培养12 d后，T细胞数扩增至基线值的（33.89±19.46）倍和（81.54±23.62）倍，CD33-TriTE促T细胞增殖能力明显优于CD33-BiTE（ P<0.05）。③体外实验证实CD33-BiTE和CD33-TriTE均可增强T细胞对表达CD33白血病细胞的特异性杀伤作用，且在一定浓度范围内，浓度越高，抗体的杀伤作用越强。④与CD33-TriTE相比，CD33-BiTE杀伤白血病细胞的同时增加其PD-L1表达，而TriTE对过表达PD-L1的Molm13细胞具有更强的杀伤作用。 结论:该研究构建了CD33-BiTE及CD33-TriTE表达载体，并在真核细胞表达了融合蛋白，体外实验证实其促T细胞增殖活化的特性，并具有促T细胞抗白血病作用。其中CD33-TriTE较CD33-BiTE促增殖效果更强，且对PD-L1高表达的白血病细胞杀伤效果更强。

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤，酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性，流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能，Fortebio测定抗体亲和力，抗体全长测序，经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)；人EGFR单克隆抗体杂交瘤系，经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因，构建scFv，克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接，克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体，使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞，获得包装病毒，感染293V细胞，FACS测定CAR膜表达，ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况，转染激活人外周血T细胞，验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3，具备高度配受体封阻性能，经人源化改造后，亲和力稳定(2.67×10 －10 mol/L)，EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2)，其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后，细胞膜表面表达EGFR-scFv，检测培养上清存在PD-L1-ScFv；CTZ0431-2感染293V细胞后，细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达，双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体，EGFR-CAR中度结合亲和力，此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。

目的:利用酵母表面递呈技术,分泌表达抗PD-L1单链抗体(sc Fv),纯化后得到能特异性结合PD-L1抗原的小分子抗体片段(sc Fv).根据单链抗体基因序列,合成sc Fv抗体基因序列.选用sc Fv-mFc融合蛋白的方式,并采用p Fuse真核表达载体来表达此sc Fv-mFc融合蛋白,研究其对肺腺癌细胞(A549)的亲和力和体内外抑制作用.方法:采用基因工程的方法构建重组质粒p Fuse-scFv,通过真核转染至293F(人胚肾细胞),使用无血清Pro 293a-CDM培养72 h,收集培养液中分泌的融合蛋白,运用免疫组化检测sc Fv-mFc融合蛋白与肿瘤细胞的结合;流式细胞术分析融合蛋白和肿瘤细胞的亲和力; ADCC(抗体介导的细胞毒实验)测定融合蛋白对肿瘤细胞体外杀伤作用;利用接种肺腺癌细胞的荷瘤小鼠对融合蛋白的体内抗肿瘤效应进行研究.结果:通过重组质粒转染至293F细胞的方法,sc Fv-mFc融合蛋白被分泌到无血清的培养液中;免疫组化和流式结果显示,融合蛋白与表面高表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞有较强的结合能力; ADCC实验结果示融合蛋白在体外对肿瘤细胞的杀伤作用;荷瘤小鼠实验结果示融合蛋白对肿瘤的生长起到抑制作用,在5 mg/kg的药物剂量下,荷瘤小鼠瘤体体积平均增长率从14.90％降低至3.72％,两独立样本t检验P＜0.05,差异具有统计学意义.结论:成功制备了含单链抗体的融合蛋白,其对A549细胞具有良好的结合能力,在体内外均对肿瘤细胞的增殖产生抑制作用,为研制靶向抗肿瘤药物提供实验室基础依据.

目的:通过优化设计、构建c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白,探究重轻链不同组合形式对c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白与肿瘤抗原结合的亲和性和特异性的影响.方法:使用生物信息学分析、基因工程抗体技术设计、优化及制备重轻链不同组合的双特异性c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白CP1、CP2、PC1、PC2;生物分子相互作用分析仪BLItz分析融合蛋白对重组c-Met蛋白和PD-L1蛋白的亲和力,ELISA法分析其抗原结合特异性.结果:成功制备双特异性c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白,融合蛋白CP1与重组c-Met蛋白和PD-L1蛋白的亲和力和抗原结合特异性均优于CP2、PC1和PC2.结论:重轻链不同组合形式会影响c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白与c-Met和PD-L1蛋白的亲和力和抗原结合的特异性,融合蛋白CP1的亲和力和抗原结合的特异性最高,其对应的重轻链组合形式可用于c-Met/PD-L1 CAR表达载体的构建.

目的 制备同时靶向胞外5'-核苷酸酶(cluster of differentiation 73,CD73)与程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)的双特异性抗体,并对其体外结合能力和杀伤能力进行评价.方法 采用基因工程方法,将PD-L1单链抗体(single-chain fragment variable,scFv)插入至CD73单抗铰链区中,构建抗CD73/PD-L1双特异性抗体(BS-21),通过CHO GS表达系统进行筛选,获得高表达量细胞株,经Protein A及分子筛纯化后,采用分子排阻高效液相色谱法(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测抗体纯度;流式细胞术检测抗体体外结合能力;通过外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)体外杀伤人肺癌细胞Calu1检测抗体体外杀伤能力.结果 经加压筛选获得了高产的细胞株;经纯化获得纯度为99.6％的双特异性抗体BS-21,该抗体能同时结合CD73和PD-L1分子;与anti CD73和anti PD-L1组相比,BS-21组显著提高免疫细胞对Calu 1肿瘤细胞的杀伤率(F均为30.36,P均＜0.001).结论 双特异性抗体BS-21能同时降低CD73和PD-L1对免疫细胞的免疫抑制作用,具有较好的抗肿瘤功能.