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EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达
编辑人员丨4天前
目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10 -10 mol/L),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。
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编辑人员丨4天前
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脑室内注射CARv3-TEAM-E T细胞用于治疗复发性胶质母细胞瘤
编辑人员丨3周前
在一项首次由研究人员发起的开放标签临床试验研究中,三名复发性胶质母细胞瘤患者接受了CARv3-TEAM-E T细胞治疗.CARv3-TEAM-E T细胞是一种嵌合抗原受体(CAR)T细胞,通过分泌T细胞结合抗体分子(TEAM),来靶向表皮生长因子受体(EGFR)变体Ⅲ肿瘤特异性抗原以及野生型EGFR蛋白.
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编辑人员丨3周前
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预后营养指数联合CAR、Alb对腹膜透析患者远期预后的预测价值
编辑人员丨1个月前
目的 评估预后营养指数(PNI)联合C反应蛋白/白蛋白比值(CAR)、血清白蛋白(Alb)对腹膜透析(PD)患者远期预后的预测价值.方法 分析纳入2019年1月至2024年1月在自贡市第一人民医院肾病内科接受PD治疗的终末期肾病患者102例,根据5年随访期间PD患者生存结局分为死亡组(n=33)和生存组(n=69).采用单因素及多因素Logistic回归分析影响PD患者远期预后的独立危险因素.绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估PNI联合CAR、Alb对PD患者生存结局的预测价值.结果 与生存组相比,死亡组患者合并糖尿病、心血管疾病及腹膜炎并发症的比例较高,差异有统计学意义(x2=0.947,4.846,5.840);肾小球滤过率(eGFR)、PNI、Alb水平降低,差异有统计学意义(t=9.495,6.068,5.422);血清肌酐(SCR)、尿酸(UA)及CAR水平升高,差异有统计学意义(t=5.369,4.581,5.048),差异均有统计学意义(P<0.05).Logistic回归分析显示,患者合并糖尿病、心血管疾病、CAR是PD患者死亡的独立危险因素(P<0.05),eGFR、PNI、Alb是PD患者死亡的独立保护因素(P<0.05).ROC曲线分析显示,PNI、CAR、Alb联合预测的曲线下面积分别为0.928,显著高于单独预测(P<0.05).结论 PNI、Alb水平降低及CAR升高是PD患者死亡的独立影响因素,三者均可为PD患者长期预后生存结局提供参考,且联合预测价值更高.
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编辑人员丨1个月前
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北京社区人群促红细胞生成素相关因素及其与10年心血管疾病风险的关系
编辑人员丨2024/1/13
目的:了解北京社区人群内源性促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的相关因素及其与10年心血管疾病发病风险的关系.方法:数据来源于2011年12月至2012年4月北京大学第一医院动脉粥样硬化队列的基线资料,采用多因素线性回归模型分析内源性EPO的相关因素,应用中国动脉粥样硬化性心血管疾病风险预测(pre-diction for atherosclerotic cardiovascular disease risk in China,China-PAR)模型计算研究对象 10 年心血管疾病发病风险,以5%、10%为切点定义低、中、高风险分层.结果:共纳入4 013名基线无心脑血管疾病、无贫血、肾功能未见异常的研究对象,女性占比62.2%(2 496人),平均年龄(55.9±8.2)岁,平均EPO水平为12.8(9.3~17.4)IU/L.10年心血管疾病风险高危者占比25.1%(998人).多因素回归结果显示,血红蛋白(β=-0.05,95%CI:-0.07~-0.04)和肾小球滤过率≥90 mL/(min·1.73 m2)(β=-0.05,95%CI:-0.07~-0.04)与 EPO 水平呈显著负相关,高血压(β=0.08,95%CI:0.05~0.12)和肥胖(β=0.14,95%CI:0.09~0.18)与内源性EPO水平升高显著相关.10年心血管疾病风险与内源性EPO水平呈显著正相关(β=0.07,95%CI:0.05~0.09),中危者以及高危者内源性EPO水平均显著高于与低危者(P均<0.05).结论:北京市社区居民内源性EPO水平与血红蛋白、肾功能、肥胖及高血压呈显著相关性,10年心血管疾病风险中、高危者内源性EPO水平显著高于低危者,可能是心血管疾病风险标志物.
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编辑人员丨2024/1/13
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甲基丙烯酰化明胶3D培养的CAR-T细胞靶向杀伤脑胶质瘤细胞的研究
编辑人员丨2023/9/30
目的 研究在甲基丙烯酰化明胶中培养的CAR-T细胞功能及活性的变化,以及用GelMA为载体,负载缓释CAR-T细胞的可行性.方法 基因编辑靶向表皮生长因子受体(EGFR)的第二代CAR-T细胞,制备负载CAR-T的甲基丙烯酸酯明胶,通过水凝胶成胶过程图像、储存及损耗模量验证水凝胶成功制备;使用荧光显微镜荧光成像、流式细胞分析验证CAR-T的成功转染;应用CCK-8实验检测水凝胶的生物相容性;构建共培养模型,利用Elisa试剂盒、细胞毒性LDH试剂盒检测上清液中释放的细胞因子、LDH,检测CAR-T是否成功活化,评估CAR-T细胞杀伤效应.结果 荧光显微镜下观察转染第4天的CAR-T细胞,见CAR-T细胞聚集成团并散发绿色荧光;第9天流式细胞术示CD3+T细胞的慢病毒转染率为42.2%,CD8+T细胞:CD4+T细胞约为1∶1,CAR-T细胞成功制备.CCK8实验示水凝胶无毒性.Elisa试剂盒示上清液中细胞活性因子IFN-γ释放量显著增多,提示CAR-T细胞识别EGFR抗体后,可成功活化.当效靶比为1:1时,U87细胞毒性为71.75%,而U87EGFRv111细胞毒性为18.13%.结论 甲基丙烯酸酯化明胶负载培养的CAR-T细胞活性良好,功能正常,可设计使用该水凝胶负载递送CAR-T细胞,实现CAR-T细胞的精确靶向治疗.
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编辑人员丨2023/9/30
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靶向EGFR嵌合抗原受体T细胞对胃癌的杀伤作用
编辑人员丨2023/9/16
目的 探讨靶向表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)对胃癌SGC-7901 细胞杀伤作用.方法 构建靶向EGFR的CAR-T,通过流式细胞仪、乳酸脱氢酶实验检测CAR-T对SGC-7901 细胞的杀伤作用;通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测SGC-7901 和CAR-T共培养干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-2 的浓度变化.结果 CAR-T对胃癌SGC-7901 细胞杀伤作用随着效靶比的增加、作用时间的延长而显著增强(P<0.05);ELISA 结果显示,CAR-T作用后分泌IFN-γ、IL-2 显著增加(P<0.05).结论 靶向EGFR的CAR-T细胞能通过增加IFN-γ、IL-2 的分泌,特异性杀伤胃癌SGC-7901细胞.
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编辑人员丨2023/9/16
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通过CRISPR/Cas9敲除PD-1有效增强EGFR-CAR-T细胞对肺癌的抗肿瘤活性
编辑人员丨2023/8/12
目的 探索基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR关联蛋白质(Cas)9 敲除程序性死亡受体(PD)-1 的靶向表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞是否可以有效抑制肺癌的进展.方法 通过慢病毒感染获得CAR-T细胞,并通过电转引导RNA(gRNA)及Cas9 蛋白敲除PD-1;流式细胞术检测CAR-T细胞阳性率、肿瘤细胞表面EGFR表达、与靶细胞共孵育后CAR-T细胞中PD-1 表达及肿瘤浸润T细胞的比例;乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测CAR-T细胞对靶细胞的细胞毒性;免疫缺陷鼠移植瘤模型检测体内抑瘤能力;免疫组化法检测肿瘤组织中PD-1 表达;结果 CAR-T细胞的阳性率均超过 40%;肿瘤细胞中NCI-H23 及A549 高表达EGFR,NCI-H1650 低表达EGFR,HCC827 不表达EGFR;CAR-T及PD-1-CAR-T细胞均可以以抗原依赖的方式杀伤肿瘤细胞,且PD-1-CAR-T细胞的杀伤活性较CAR-T细胞更强(P<0.05);此外,PD-1-CAR-T细胞与靶细胞共孵育后PD-1 细胞比例更低(P<0.01);PD-1-CAR-T细胞的体内抑瘤能力更强,且可以更显著地延长小鼠生存期;PD-1-CAR-T细胞在肿瘤中的增殖水平更高(P<0.001),且PD-1-CAR-T组肿瘤中PD-1 细胞数更低(P<0.001).结论 CRISPR/Cas9 介导的PD-1 敲除可以在体外和体内改善CAR-T细胞的效应功能,增强其对肺癌的抑制活性.
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编辑人员丨2023/8/12
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PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制剂与肿瘤免疫治疗
编辑人员丨2023/8/6
磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3 K-AKT-mTOR)信号通路的上游通路主要包括表皮生长因子受体(EGFR)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、肝细胞生长因子受体(MET)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)等各类受体的酪氨酸激酶,其受体的突变、扩增常会导致PI3K-AKT-mTOR信号通路的失调,引起肿瘤发生发展.该通路异常激活常伴随着下游关键分子的改变包括PIK3CA、AKT1、PTEN的基因突变,PIK3CA、AKTI、AKT2的基因扩增,肿瘤抑制基因PTEN的缺失等.PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制剂主要包括PI3K抑制剂、AKT抑制剂、mTOR抑制剂和双重抑制剂等.PI3K-AKT-mTOR抑制剂对肿瘤免疫微环境、免疫细胞均有显著影响.PI3K-AKT-mTOR抑制剂单药治疗肿瘤具有一定局限性,如联合DC疫苗、免疫检查点抑制剂和CAR-T细胞等免疫疗法可增强抗肿瘤疗效.
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编辑人员丨2023/8/6
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肿瘤特异性嵌合抗原受体EGFRvⅢ-CAR的构建及体外活性分析
编辑人员丨2023/8/6
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor-T,CAR-T),是通过体外激活和扩增肿瘤特异或非特异性杀伤细胞达到抗肿瘤效果,在肿瘤免疫治疗方面具有良好的应用前景.本研究构建靶向EGFRⅢ(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ)的嵌合抗原受体(CAR)的重组慢病毒表达载体,利用慢病毒感染并筛选能够稳定表达该嵌合抗原受体的Jurkat细胞系.通过EGFRvⅢ分子刺激、与U87MG细胞共培养的方式检测细胞系的活化状况.结果显示,成功构建了pCDH-EGFRvⅢscFv-CAR-copGFP-T2A-puro慢病毒表达重组质粒,并筛选出可稳定表达EGFRⅢ-CAR的Jurkat细胞系.CCK-8法检测显示,EGFRvⅢ分子刺激12h的Jurkat-CAR细胞增殖率约是对照组的1.36倍(P<0.05);ELISA法检测显示,与U87MG细胞共孵育后,细胞上清中IL-2的浓度约是单独培养分泌在上清中IL-2的1.625倍(P<0.01).以上结果表明,稳定表达CAR的iurkat细胞,可以靶向性识别EGFRvⅢ分子及EGFRvⅢ阳性的靶细胞,并引起IL-2细胞因子释放,为后续临床细胞免疫治疗提供了理论基础.
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编辑人员丨2023/8/6
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下咽鳞状细胞癌CAR-EGFR修饰T细胞构建的初步研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 构建具有靶向功能下咽鳞状细胞癌Fadu细胞系,EGFR-CART细胞并进行验证,为CART细胞技术在下咽鳞状细胞癌治疗应用临床前基础进行探索.方法 通过慢病毒转染构建EGFR-CART细胞及CART-对照细胞,FACS荧光检测CART细胞上EGFR抗体的表达,验证 Fadu细胞系及HCT-116细胞系中EGFR的表达.结果 成功构建了EGFR-CART细胞及CART-对照细胞,感染效率约为67%,二者在细胞亚群的分布上没有明显区别.靶细胞功能验证发现HCT-116中EGFR低表达,Fadu中EGFR高表达,确定HCT-116作为EGFR-CART的非靶细胞,Fadu作为靶细胞.结论 本研究成功制备并验证了具有靶向功能的下咽鳞状细胞癌Fadu细胞系的EGFR-CART细胞,为CART技术在下咽癌治疗中的应用打下了前期基础.
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编辑人员丨2023/8/6
