目的 以忍冬Lonicera japonica八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因为标记基因,利用ZMBJ-CMV载体建立基于病毒诱导的忍冬基因沉默体系.方法 以忍冬为材料,通过选取同源性较高的片段设计PDS基因的特异性引物,克隆出片段长度为135 bp的序列作为目的基因片段,经双酶切后与黄瓜花叶病毒载体连接构建VIGS重组载体,转化根癌农杆菌后,侵染忍冬幼苗.此外,还对农杆菌吸光度(A)值和侵染方法对PDS基因沉默效率的影响进行了比较.结果 被侵染植株叶片PDS基因表达水平显著降低,叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降,叶片出现白化表型.结论 建立了以ZMBJ-CMV载体诱导的忍冬基因沉默体系,农杆菌A值为0.8、注射后再进行真空浸润,能够提高忍冬目标基因的沉默效率,为开展忍冬关键基因的功能研究提供了技术支撑.

三角梅是紫茉莉科灌木,具有较高的观赏价值,是研究花色叶色调控的理想材料.建立快速高效的基因验证体系,是三角梅基因功能研究的关键.以三角梅'金心双色'品种为材料,选用八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)为指示基因,探索不同接种部位和基因片段长度对烟草脆裂病毒(TRV)诱导三角梅叶片内源PDS mRNA沉默效果的影响,建立适用于三角梅的病毒诱导基因沉默体系(VIGS).结果表明,摩擦注射嫩叶法相比顶端嫩茎沉默效果更明显;基因沉默片段长度在 336 bp和 457 bp均可诱导PDS基因沉默,后者效果更加明显.初步构建了三角梅VIGS体系,为后续基因功能研究提供了技术参考.

该研究根据黄秋葵(Hibiscus esculentus L.)转录组测序获得的八氢番茄红素脱氢酶基因(HePDS)序列(GenBank登录号为MG372370)设计引物,克隆验证得到1条HePDS基因全长为2 020 bp cDNA,开放阅读框(ORF)包含l 686个碱基;预测其编码561个氨基酸,理论分子量为62.62 kD,等电点为8.155;编码的蛋白与海岛棉(Gossypium barbadense)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)、陆地棉(Gossypium hirsutum)同源蛋白的相似性均在93％以上,均含有1个保守的二核苷酸结合域和1个类胡萝卜素结合域,显示其高度的保守性.荧光定量PCR分析表明,HePDS基因在黄秋葵根、茎、叶、花和果荚中均有表达;叶发育过程以嫩叶中表达最高,果实发育中以花后2d表达量最高.类胡萝卜素含量随着叶、果实发育逐渐升高,成熟叶的含量最高,果实以花后4d含量最高,且HePDS基因的表达与类胡萝卜素含量存在密切的相关性.该研究结果为进一步探讨HePDS基因的功能和调控机制,以及采用VIGS和CRISPR/Cas9技术开展黄秋葵基因功能的反向遗传学研究奠定了基础.

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素进行生物合成途径中的关键酶.为了深入探究金鱼草PDS基因的功能,该研究以‘马里兰’金鱼草(Antirrhinum majus ‘Maryland True Pink')为材料,对其PDS基因(AmPDS)全长序列及蛋白结构进行分析,并克隆了AmPDS基因片段;采用qRT-PCR技术检测AmP-DS基因在不同时期及部位的相对表达水平,利用VIGS技术验证AmPDS基因功能,用紫外分光法测定叶片中各类色素含量.结果 显示:(1)成功克隆AmPDS基因片段(500 bp);AmPDS基因eDNA全长1 743 bp,编码580个氨基酸;其蛋白分子量为64.75 kD,理论等电点6.66;同源比对分析显示AmPDS基因与芝麻(Sesamum indicum)的序列相似性最高.(2) qRT-PCR分析表明,AmPDS基因在全株均有表达,且在全盛期花朵的上瓣和叶片中表达量最高.(3)构建pTRV2-AmPDS载体,建立了金鱼草的VIGS沉默体系,AmPDS基因沉默效率约为53％,与阴性对照相比叶片中各类色素含量均显著降低.研究认为,AmPDS基因是金鱼草类胡萝卜素生物合成途径中的关键基因,可作为金鱼草VIGS沉默体系的指示基因,为后续研究金鱼草其他基因功能奠定基础.

水稻穗发芽是一种多发性的自然灾害,给水稻生产造成了严重的经济损失.由于穗发芽机制还不完全清楚,如何培育抗穗发芽的水稻品种,已成为世界性的难题.本研究利用水稻甲基磺酸乙酯诱变突变体库,通过田间筛选,获得9个水稻稳发芽突变体.并对其中2个突变体进行研究,利用基于基因组重测序的SIMM方法和高分辨率溶解曲线分析技术,分别获得其穗发芽候选基因LOC_Os03g08570和LOC_Os07g10490.LOC_Os03g08570编码一个八氢番茄红素脱氢酶,LOCOs07g10490编码一个ζ-胡萝卜素脱氢酶,它们都参与脱落酸前体类胡萝卜的合成.本研究的结果进一步证明类胡萝卜素的合成在水稻休眠中的关键作用.同时,本研究获得的这些穗发芽突变体为后续深入研究水稻穗发芽的分子机制及开展分子设计育种提供了宝贵材料.

小报春是报春花科报春花属的二年生草本花卉,具有较高的观赏价值和园林应用前景,是研究花柱二型的理想材料,建立快速高效的报春花属基因功能验证技术,是小报春基因功能研究中的关键问题.以小报春为材料,以八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因作为标记基因,探索TRV病毒载体在小报春中的最佳侵染对象、侵染液配方、菌液浓度和侵染方式,建立适用于小报春的VIGS体系.结果表明,用含有200μmol/L乙酰丁香酮(AS)、10 mmol/L MgCl2和10 mmol/L乙磺酸缓冲液(MES)的浸染液,将含有pTRV1和pTRV2-PfPDS的菌液OD600值均调至1.0等体积混合后通过叶背注射方式侵染小报春,以TRV病毒载体上的引物对处理后的植株叶片进行PCR,在出现表型变化的植株和空载组中均检测到TRV1和TRV2的病毒载体,白化植株的PfPDS表达量显著低于空载组和对照组.建立的VIGS体系侵染效率达60％,沉默表型可持续12个月之久,并能在小报春植株的各部位(从叶片到萼片)均起到沉默作用.建立了小报春基因沉默体系,由于沉默效果持续时间长,所有基因都可以利用这一方法进行功能验证.