植物在生长发育过程中面临各种非生物胁迫.其中干旱胁迫严重影响作物生长,降低其产量.植物中以TB2/DP1结构域为特征的HVA22蛋白参与调控生长发育和非生物胁迫响应.然而,HVA22在番茄(Solanum lycopersicum)干旱胁迫响应中的功能尚不清楚.该研究探索了番茄SIHVA22/基因的功能.结果表明,番茄SIHVA22I与其它双子叶植物中的HVA22I同源蛋白具有较高的序列相似性.表达模式分析显示,SIHVA22/基因表达受干旱胁迫和植物激素(ABA和MeJA)诱导.此外,通过酵母(Saccharomyces cerevisiae)异源表达和病毒诱导基因沉默技术沉默番茄SIHVA22/基因,验证了SIHVA22/基因的抗旱功能.干旱处理后沉默植株表现出较高的过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量,以及较低的O2-·清除率,且其超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性较对照显著降低.综上表明,S/HVA22/基因在番茄抵御干旱胁迫中发挥重要作用.

[目的]为探究月季重瓣性状的调控机制,研究克隆了前期筛选到的1个与花发育相关的AG同源基因RcAGL61,并对其功能进行分析.[方法]用荧光定量对该基因在'窄叶藤本月季花'×'月月粉'杂交群体中重瓣株系和单瓣株系花芽5个发育时期的表达模式进行分析,以重瓣株系和单瓣株系为材料,克隆RcAGL61,并进行生物信息学分析、亚细胞定位及VIGS实验.[结果](1)该基因表达水平在单瓣株系的5个发育时期均显著高于重瓣株系,在单瓣株系花发育的S4-S5期比S1-S3期表达量明显升高.(2)RcAGL61编码区序列在单瓣株系和重瓣株系中一致,长度为495 bp,与RcAG基因序列相似度为30.75％,编码164个氨基酸,含有1个MADS-box保守结构域,属于MADS-Box基因家族.(3)RcAGL61蛋白定位于烟草表皮细胞的细胞核.(4)沉默该基因后,瓣化雄蕊数量增加,雄蕊数量减少,花瓣数量增加,萼片数量和雌蕊数量无显著变化.[结论]RcAGL61参与调控雄蕊原基和花瓣原基间的转变,影响月季的花瓣数量.

大豆花叶病毒(SMV,soybean mosaic virus)病是世界大豆主产区广泛存在且普遍发生的主要病害之一,对大豆的产量和品质均可造成严重危害.本文综合分析了近年来通过遗传定位发现的大豆花叶病毒抗性基因及其紧密连锁的分子标记,探讨了分子标记在提高大豆抗病育种中的应用,总结了 RSC3(w)、RSC14-r和RSC18等抗大豆花叶病毒基因的物理位置及其候选基因.基于候选基因测序、实时荧光定量PCR、病毒介导基因沉默(VIGS,virus induced gene silencing)和基因编辑CRISPR/Cas9等技术梳理出GsCAD1、GmCAL和GmMLRK1等一系列直接或间接参与大豆花叶病毒抗性的相关基因,为大豆抗大豆花叶病毒基因调控网络的完善奠定了基础.本综述总结分析了大豆与大豆花叶病毒的相互作用机制,聚焦分析大豆抗性基因Rsv3等对大豆花叶病毒抗病机制研究进展,并对抗大豆花叶病毒育种的研究方向提出了展望,以期为大豆抗性基因分子标记的应用和分子调控机制的研究提供参考.

[目的]叶绿素酸酯a加氧酶(CAO)是叶绿素b形成过程中的关键酶,对杂交兰CAO基因进行克隆及表达特征分析可为探究其在杂交兰叶艺形成中的调控作用奠定基础.[方法]以杂交兰'紫妍氏'(K21)及其叶艺品系'中透紫妍氏'(K21-3)为试验材料,用RT-PCR和RACE技术从叶片中克隆获得ChCAO基因,对ChCAO进行结构特征、理化性质、序列比对以及系统进化关系等分析;用qRT-PCR法对ChCAO在不同组织及叶艺品系叶片中的表达特性进行分析;并用VIGS技术对ChCAO进行沉默表达.[结果]ChCAO基因编码区长1 608 bp,编码535个氨基酸,ChCAO与墨兰CAO亲缘关系最近,并与其他兰科植物CAO聚为一类.qRT-PCR结果显示,ChCAO基因表达具有组织特异性,在叶中相对表达量最高,根中相对表达量最低;此外,ChCAO在K21绿叶和K21-3绿叶区域叶片中的相对表达量显著高于K21-3叶艺区域叶片中的相对表达量.构建该基因的VIGS沉默载体转化烟草,发现沉默ChCAO后烟草叶片呈黄化状态,叶片中的叶绿素含量及ChCAO基因的相对表达量也显著降低.[结论]克隆获得了杂交兰ChCAO基因,并对其功能进行了初步鉴定,为进一步研究杂交兰叶艺形成机理提供重要依据.

目的 以忍冬Lonicera japonica八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因为标记基因,利用ZMBJ-CMV载体建立基于病毒诱导的忍冬基因沉默体系.方法 以忍冬为材料,通过选取同源性较高的片段设计PDS基因的特异性引物,克隆出片段长度为135 bp的序列作为目的基因片段,经双酶切后与黄瓜花叶病毒载体连接构建VIGS重组载体,转化根癌农杆菌后,侵染忍冬幼苗.此外,还对农杆菌吸光度(A)值和侵染方法对PDS基因沉默效率的影响进行了比较.结果 被侵染植株叶片PDS基因表达水平显著降低,叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降,叶片出现白化表型.结论 建立了以ZMBJ-CMV载体诱导的忍冬基因沉默体系,农杆菌A值为0.8、注射后再进行真空浸润,能够提高忍冬目标基因的沉默效率,为开展忍冬关键基因的功能研究提供了技术支撑.

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术为缺乏稳定遗传转化体系的植物进行基因功能分析提供了可能,为解决缺少稳定遗传转化体系的植物进行基因功能验证的需求,以单子叶植物溪荪(Iris sanguinea)为材料,克隆IsPDS基因的特异性片段并构建其VIGS重组载体pTRV2-IsPDS,通过注射法侵染溪荪叶片,结果显示:pTRV1和pTRV2-IsPDS的菌液OD600调至1.8～2.0后重悬,重悬液OD600调至0.8～1.0,通过注射器叶脉注射方式侵染溪荪叶片效果最佳.在室外温度为15～20℃的下午6～8时进行,用1 mL注射器针头扎伤溪荪叶片外表皮,沿着平行脉缓慢注射重悬液1 mL至溪荪叶片维管束中,14 d左右会出现明显的白化表型.在出现表型变化的植株和空载组中均检测到TRV1和TRV2的病毒载体,白化植株的IsPDS表达量显著低于对照组.侵染液配制中通过提高携带病毒载体的农杆菌的浓度提高侵染效率,且接种后无需遮光.

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术已广泛用于植物基因功能研究,以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)为载体的沉默体系介导大豆基因沉默效率有待明确,采用无缝克隆技术构建TRV-VIGS沉默体系,探索不同接种方法对大豆靶基因在不同组织间的沉默效率,为大豆基因功能研究提供依据.以八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase,GmPDS)及泛素连接酶(GmATL3)基因为靶基因,将含有pTRV1 和重组载体菌液采用注射、灌根(agroinoculation)、注射与灌根相结合 3 种方法分别接种大豆中黄 13,接种 28 d观察沉默表型现象,并使用RT-qPCR技术检测根部与叶部基因相对表达量,明确不同方法沉默效果.注射接种的大豆叶边缘及叶内出现黄化褪绿,灌根接种与注射加灌根接种的叶片表面出现褪绿斑点及褶皱褪绿表型.RT-qPCR结果表明,3 种接种方法对沉默GmPDS效果接近 100%;注射接种对GmATL3 的沉默效率在叶部为 80%-95%,根部为 40%-60%;灌根与注射加灌根接种,根部沉默效率为 70%-90%,叶部沉默效率为 15%-50%.不同接种方法产生不同程度沉默表型,且对不同内源基因沉默效率不同.接种方法对不同组织沉默效率存在差异,注射方法对叶片沉默效率最高,注射加灌根结合的方法对根部沉默效率最高.

三角梅是紫茉莉科灌木,具有较高的观赏价值,是研究花色叶色调控的理想材料.建立快速高效的基因验证体系,是三角梅基因功能研究的关键.以三角梅'金心双色'品种为材料,选用八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)为指示基因,探索不同接种部位和基因片段长度对烟草脆裂病毒(TRV)诱导三角梅叶片内源PDS mRNA沉默效果的影响,建立适用于三角梅的病毒诱导基因沉默体系(VIGS).结果表明,摩擦注射嫩叶法相比顶端嫩茎沉默效果更明显;基因沉默片段长度在 336 bp和 457 bp均可诱导PDS基因沉默,后者效果更加明显.初步构建了三角梅VIGS体系,为后续基因功能研究提供了技术参考.

Rose has emerged as a model ornamental plant for studies of flower development,senescence,and morphol ogy,as well as the metabolism of floral fragrances and colors.Virus-induced gene silencing (VIGS) has long been used in functional genomics studies of rose by vacuum infiltration of cuttings or seedlings with an Agrobacterium suspension carrying TRV-derived vectors.However,VIGS in rose flowers remains a challenge because of its low efficiency and long time to establish silencing.Here we present a novel and rapid VIGS method that can be used to analyze gene function in rose,called ‘graft-accelerated VIGS',where axillary sprouts are cut from the rose plant and vacuum infiltrated with Agrobacterium.The inoculated scions are then grafted back onto the plants to flower and silencing phenotypes can be observed within 5 weeks,post-infiltration.Using this new method,we successfully silenced expression of the RhDFR1,RhAG,and RhNUDX1 in rose flowers,and affected their color,petal number,as well as fragrance,respectively.This grafting method will facilitate high-throughput functional analysis of genes in rose flowers.Importantly,it may also be applied to other woody species that are not currently amenable to VIGS by conventional leaf or plantlet/seedling infiltration methods.

病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是一种根据植物反抗病毒入侵机制而开发的RNA沉默技术.它利用病毒载体携带目的基因片段在寄主体内产生双链RNA从而诱导目的基因沉默.该技术的应用依赖于植物体内发生的精密且有效的分子调控网络与合适的侵染条件.相较于其他的植物诱变技术,VIGS有着其独特的优势,目前不仅在模式植物中有所应用,而且在诸多其他的单子叶及双子叶植物中也有报道.此外,随着新的载体系统、侵染条件与检测手段等不断出现,VIGS技术越来越多的特点被大家发现,并成为基因功能研究的得力工具.