目的 为了获取独立的内耳三维模型,探讨一种半自动、快速的内耳分割方法.方法 将MRI图像导入3D slicer软件,基于Otsu法,采用半自动分割内耳,并结合meshlab软件进行内耳后期精细处理.结果 对30例MRI影像数据进行分割,一侧内耳完成半自动分割仅需3钟左右,内耳三维模型图像清晰,内耳信息保留完整.结论 Otsu法进行内耳半自动分割操作简单、快捷,内耳模型结构完整,三维成像效果好.

由于内耳独特的解剖特点和血迷路屏障的存在,要实现内耳治疗靶点精准的基因递送,必须选择适合的手术路径.大量文献表明经圆窗入路及耳蜗开窗(鼓阶/中阶)径路均可将基因成功递送到内耳并表达,转染效率及听力损伤程度各有不同.本文综述内耳基因递送入路并分析各自的优劣,同时关注不同入路对听觉功能的影响.为内耳基因治疗中的听觉功能保护提供新思路.

耳聋是最常见的致残性疾病之一,遗传性耳聋是新生儿常见的疾病,目前治疗耳聋的方法比如助听器、振动声桥及人工耳蜗等,刺激感音毛细胞和螺旋神经节,弥补听力损失,然而,这些助听装置在频率敏感性、言语分辨及噪声环境下还有许多缺陷.因此,内耳的基因治疗有望成为遗传性耳聋的理想治疗方法.基因治疗目前仍还无法从基础研究转化为临床应用.主要的困难之一是缺乏基因递送技术,在安全有效地进行内耳细胞靶向递送的同时,可以实现外源基因导入活体内耳后的持续作用.基因递送技术的重要技术环节包括内耳导入途径和基因载体.耳蜗中阶、圆窗、卵圆窗是内耳基因治疗的传统手术径路,最近研究较为热门的是半规管开窗技术,半规管开窗基因导入手术方式是一种即可以保存听力,又能有效的将目的 基因导入前庭和耳蜗的有效路径.通过构建缺陷基因载体以及比较不同的手术入路导入路径,获得高效、安全、控释和靶向特异的外源分子内耳递送技术,即获得了很好的治疗效果又保存了听力和内耳的感音结构,有着广泛的应用前景.

目的 明确小型猪耳后入路内耳导入的手术过程中相应的解剖标志及注意事项,论证其保存外耳和中耳传音特性的可能性.方法 选择6月龄贵州小型猪5头,麻醉后手术分为五个主要步骤进行:1.耳后沟切开;2.暴露茎突;3.暴露面神经;4.轮廓化外耳道;5.暴露鼓室、圆窗及鼓阶导入.结果 每个步骤的主要解剖标志为:1.眶下缘、颧弓上缘、耳后沟、下颌骨升支、耳后肌腱;2.茎突尖、茎突脊、茎突根部隆起、枕骨髁;3.面神经垂直段、骨性外耳道;4.面神经与外耳道间的"小舌"状骨片;5.上鼓室外侧壁、面神经水平段,鼓索神经、圆窗.主要的解剖要点为:1.耳后切开长度约6cm;2.骨面暴露向后不要超过茎突脊尾侧0.5cm;3磨骨范围不必超过面神经垂直段尾侧;4.不要损伤外耳道皮肤;5.鼓膜掀起范围要尽量小,导入方向为圆窗腹侧部.结论 耳后入路内耳导入手术过程中解剖标志明确,是理想的导入方式,但由于小型猪自身解剖特点,耳后入路必然会部分改变外耳和中耳的传音特性.

近年来关于内耳药物递送的研究相继展开并取得了一定的成果,内耳药物的递送是将治疗药物通过相应途径输送至内耳靶细胞.目前的研究主要集中于药物给药途径和药物载体两个方面,前者包括全身给药、经中耳鼓室给药和内耳内直接给药,而经鼓室及内耳内直接给药是目前研究的热点;药物载体主要包括各种多聚物凝胶载体、纳米粒子载体、病毒载体等,后二者在内耳基因治疗中可将目的 片段基因导入内耳.本文主要针对这两个方面的相关进展进行综述.

移植干细胞来源的选择、干细胞定向诱导分化、内耳移植途径的选择及移植后内耳功能恢复状况的评估是干细胞临床应用的研究热点.干细胞种类选择以及移植途径不同是影响内耳移植安全性及内耳功能恢复效果的两个重要因素,也是目前研究干细胞移植治疗耳聋的重点.本文就上述两者对感音神经性耳聋的治疗机制的相关文献进行综述,从而为耳聋传统治疗方案提供更新的指导.

目的 观察腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)血清型9(AAV9)在不同年龄小鼠耳蜗中的感染和表达情况.方法 将携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的AAV9通过圆窗注射或中阶注射两种途径分别导入不同年龄组小鼠的内耳,根据年龄和注射部位分为4组(每组6只):P1SM组,出生后1天(P1)小鼠经中阶注射;P1RW组,出生后1天(P1)小鼠经圆窗注射;P9RW组:出生后9天(P9)小鼠经圆窗注射;P30RW组,成年小鼠(P30)经圆窗注射.4组小鼠注射后1个月行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测试以及耳蜗基底膜铺片观察GFP在内耳中的表达情况(所有小鼠均左耳手术注射AAV9,右耳做为空白自身对照).采用GraphPad Prism 5统计软件进行数据分析.结果 GFP可特异性表达于耳蜗毛细胞,新生小鼠(P1)两种注射途径均可导致GFP在内、外毛细胞高表达,且注射耳ABR反应阈值与对侧非注射耳相比,差异无统计学意义(P值均>0.05).P9RW组小鼠耳蜗内毛细胞GFP表达均为阳性,而外毛细胞表达明显下降;P30RW组仅内毛细胞GFP表达阳性,其外毛细胞无阳性表达.P9RW组与P30RW组注射耳ABR反应阈值较对侧耳均明显提高,差异有统计学意义(P值均<0.01).结论 AAV9转染新生小鼠后可在耳蜗内、外毛细胞中高表达,且对小鼠ABR反应阈无明显影响;成年小鼠内耳转染AAV9后,仅在内毛细胞表达,并造成小鼠ABR反应阈升高.AAV9在新生小鼠耳蜗中的转染效率明显高于成年小鼠.

目的 探索腺相关病毒载体Anc80L65对正常和不同程度损伤的成年小鼠椭圆囊前庭感觉上皮的转染特性.方法 将6周龄小鼠分为以下三组.1)正常对照组:将携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的Anc80L65病毒液(Anc80L65-GFP),经后半规管注射途径导入小鼠内耳;2)中度损伤组:行水平半规管注射导入150μg链霉素,术后2周通过后半规管注射导入Anc80L65-GFP病毒液;3)重度损伤组:行水平半规管注射导入400μg链霉素,术后2周行后半规管注射导入Anc80L65-GFP病毒液.导入病毒后4周取椭圆囊行免疫荧光染色,观察椭圆囊的形态及GFP在椭圆囊感觉上皮的表达情况.结果 正常对照组:Anc80L65-GFP病毒液注射后,正常椭圆囊毛细胞无明显缺失,纤毛形态正常,GFP广泛分布于整个感觉上皮区域.中度损伤组:椭圆囊前庭毛细胞数量明显减少,支持细胞仍存活,GFP广泛分布于整个感觉上皮区域.高倍镜下见前庭支持细胞和毛细胞被转染.重度损伤组:椭圆囊的前庭毛细胞和支持细胞均被损伤,前庭感觉上皮演化为细胞大小不一、形态不规则的扁平上皮结构.在前庭扁平上皮中,GFP阳性细胞数量与对照组及中度损伤组相比明显减少.结论 Anc80L65能高效转染正常和中度损伤后的成年小鼠椭圆囊前庭感觉上皮,但对重度损伤后形成的前庭扁平上皮的转染效率较低,这可能与其细胞属性发生改变有关.在未来的前庭基因治疗研究中,须根据前庭感觉上皮的不同损伤程度来选择合适的载体.

目的 探讨小鼠半规管阻塞及半规管给药模型建立的可行性及其优势.方法 选取2月龄健康CBA小鼠20只.10只进行外侧半规管和后半规管开窗并阻塞手术,观察术后半规管形态学的变化;另10只进行小鼠经后半规管开窗后注射Texas Red耦合(作为示踪剂)的庆大霉素,后观察荧光在内耳中的分布.结果 建立经小鼠外侧半规管和后半规管开窗并阻塞手术模型后,半规管形态学显示阻塞完全;Texas Red标记的庆大霉素经后半规管注射30分钟后即可成功充满整个内耳,椭圆囊、壶腹以及耳蜗基底膜中也可以清晰观察到荧光.结论 小鼠外侧半规管和/或后半规管阻塞手术的模型建立是确切可行的;通过小鼠半规管开窗注射是一种有效的将药物导入内耳尤其是毛细胞的方法,可为研究药物的耳毒性机制、耳保护性药物的作用机制和基因治疗提供了研究思路和相关技术参考.

目的 探讨不同血清型的腺相关病毒经后半规管途径导入成年小鼠转染内耳细胞的效率及安全性.方法 将20只6～8周C57BL/6J小鼠采用数字表法随机分为5组:腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)4组,AAV8病毒注射组、AAV9病毒注射组、AAVie病毒注射组和Anc80L65病毒注射组,均采取后半规管路径进行注射,每只注射病毒溶液2μL;正常对照组,每只注射0.9％(质量分数)氯化钠注射液2μL,均以左耳为手术耳.各组于术前1 d及术后2周行听觉脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检查,随后取材进行免疫荧光染色观察病毒在基底膜的分布情况.结果 AAV8组:术后2周观察见耳蜗顶中转34.6％ ±1.8％内毛细胞被转染,中底转39.0％ ±5.9％内毛细胞表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP);AAV9组:术后2周见耳蜗顶中转92.5％ ±1.1％内毛细胞被转染,中底转94.6％ ±1.0％内毛细胞表达GFP;AAVie组:术后2周见耳蜗顶中转96.7％ ±1.5％内毛细胞被转染,中底转97.7％ ±0.8％内毛细胞表达GFP;Anc80L65组:术后2周见耳蜗顶中转62.5％ ±3.3％内毛细胞转染,中底转63.1％ ±6.1％内毛细胞表达GFP;正常对照组未见GFP表达.结论 经半规管途径注射AAVie、AAV9病毒溶液可以高效转染到耳蜗内毛细胞,此结果对耳聋疾病的内耳基因治疗具有一定的参考意义.