目的:探讨冲击波对三维培养软骨细胞增殖和抑制去分化的作用。方法:构建海藻酸盐封装的软骨细胞微球，用不同强度冲击波(分5组：空白对照组、1 bar组、2 bar组、3 bar组、5 bar组，1 bar＝100 kPa)刺激，观察平面与三维、静态与动态培养下软骨细胞形态。细胞计数试剂盒(CCK-8)法和钙黄绿素(Calcein AM)-碘化丙啶(PI)活死细胞染色检测不同时间点软骨细胞增殖凋亡。PCR检测软骨相关标志物Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、蛋白聚糖(Aggrecan)表达。组织学染色观测软骨细胞形态与基质表达，组间比较采用方差分析。结果:三维培养的软骨细胞在冲击波刺激下保持圆形形态，存活良好。低能量能够刺激细胞增殖，达到3 bar或以上时，细胞死亡增多，存活率下降。静态组第14天Col-Ⅰ表达明显高于第1天(3.687±0.156， t＝14.240， P<0.01)，与动态组第14天比较(2.887±0.424， t＝3.065， P<0.05)差异有统计学意义。第7天和第14天静态组Col-Ⅱ(0.334±0.100和0.140±0.046)与动态组(0.677±0.146和0.363±0.110)比较，差异均有统计学意义( t＝3.363、3.231， P<0.05)；静态组Aggrecan在第14天下降明显(0.077±0.050)，低于动态组(0.247±0.085， t＝2.979， P<0.05)。阿尔新蓝和番红O组织学染色观察到刺激组软骨细胞密集分布和相关糖胺聚糖产物的沉积。 结论:体外冲击波刺激能够更好地维持体外三维培养软骨细胞的表型，抑制去分化。

目的:构建一种稳定高效的人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向软骨中胚层方向分化的培养方法,初步探究hiPSCs来源的软骨用于关节软骨再生的可能.方法:通过模拟体内发育过程和三维(three dimensions,3D)悬浮培养体系,逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层和成熟的软骨组织分化;利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫荧光及免疫组织化学技术检测整个培养过程中多能干性、中胚层及软骨相关基因和蛋白的动态变化;最后利用裸鼠皮下模型研究hiPSCs软骨球软骨表型的稳定性及成瘤性.结果:通过模拟体内发育过程,成功逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化,最终分化为成熟的软骨组织.结论:本研究成功构建了一种稳定高效诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化的培养体系,为探究hiPSCs介导的软骨组织发育和再生提供了一个研究平台.

背景:与传统二维培养相比,三维培养软骨微组织具有更大的优势,但仍需进一步探索更有利的三维培养方式.目的:评价2种三维培养方式下微组织的细胞行为及促软骨形成能力.方法:通过化学脱细胞方法和组织粉碎方法制备软骨源性微载体,采用DNA定量和核染色验证脱细胞是否成功,通过组织学染色观察脱细胞前后基质保留情况,采用扫描电子显微镜和CCK-8方法对微载体进行表征;通过三维静态培养法和三维动态培养法将软骨源性微载体与人脂肪间充质干细胞结合构建软骨源性微组织,利用扫描电子显微镜、活死染色、RT-qPCR等手段检测两组微组织的细胞活力及成软骨能力.结果与结论:①成功制备软骨源性微载体,与脱细胞前相比,脱细胞后DNA含量显著降低(P<0.001);扫描电子显微镜观察微载体表面有胶原包绕,保持天然软骨细胞外基质特征;CCK-8法检测表明微载体无细胞毒性且能够促进细胞增殖;②扫描电子显微镜及活死染色结果显示,相比三维静态组,三维动态组微组织细胞具有更舒展的形态,细胞与细胞间、细胞与基质间、基质与基质间形成广泛的连接;③RT-qPCR结果表明两组微组织SOX9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达在培养7 d或14 d时均增高;14 d时三维动态组各基因相对表达量均显著高于三维静态组(P<0.05);21 d时三维静态组各基因表达均显著高于三维动态组(P<0.001);④结果表明,与三维静态培养微组织相比,三维动态培养微组织可在更短时间实现软骨相关基因的高表达,显示出更好的细胞活性和成软骨能力.

目的 探讨基于三维打印技术制备异烟肼/利福平/聚乳酸环形缓释制剂的可行性,并对打印的缓释剂的体外释放性能及生物相容性进行检测.方法 将聚乳酸制成大小为75 ～ 100 μm的粉末,异烟肼和利福平药物分别溶解于有机溶剂中作为三维打印的黏结液,三维打印机通过层层黏结的原理,将聚乳酸逐层黏结成环形植入剂,用动态浸泡的方法研究该植入剂的体外释放特征,通过体外细胞培养实验检测植入剂的细胞相容性.结果 将异烟肼或利福平溶解于黏结液中,以聚乳酸为载药基质能够实现多载药缓释植入剂的三维打印;在电镜下药物成巢状分布于植入剂内.双载药环形植入剂在体外能够持续释放32 d以上,在体外释放32 d测得的异烟肼和利福平的浓度高于药物的最低有效抑菌浓度.细胞毒性实验以及体外直接接触实验表明该植入剂无细胞毒性,具有良好的生物相容性.结论 所配制的载药聚乳酸三维打印方法能够实现双载药植入剂的制备,为抗结核药物的局部缓释制剂的制备提供了新方法.

血脑屏障研究对神经系统疾病的药物研制有着重要的作用.细胞体外培养模型有助于研究脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞等血脑屏障内主要组成细胞的生理作用及生物特性,从而观测、分析给药过程中各部分的反应状况,优化给药过程,减弱毒性反应.根据血脑屏障细胞的特性,笔者介绍了现阶段较常用的单层模型、共培养模型和较为前沿的三维动力学模型等培养模型,并通过对各个模型优缺点的分析,提出了基于不同研究目的选择合适体外模型的建议.

目的 观察动态力学加载对低温3D打印联合冷冻干燥法制备的三维仿生复合支架材料内MC3T3-E1细胞增殖、分化、成骨特异性基因表达的影响.方法 将丝素蛋白、Ⅰ型胶原、羟基磷灰石按质量比3:9:2混合后,采用低温3D打印联合冷冻干燥技术制备三维仿生复合支架;大体观察支架外形,Micro-CT观察支架孔径及孔隙率,测定吸水膨胀率以及应力、应变、弹性模量.取MC3T3-E1细胞接种至三维仿生复合支架,随机分成两组:实验组培养期间行动态力学加载,每天1次、每次15 min、频率l Hz、应变3 500μs;对照组不作力学加载.培养7、14d,分别对细胞-支架复合物行HE染色及扫描电镜观察细胞在支架上生长情况;Western blot以及实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原、BMP-2、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白及mRNA表达.结果 制备的三维仿生复合支架为白色立方体网格,Micro-CT检测见支架材料内部呈孔隙网状结构,孔隙连通性良好;大孔径直径为(506.37±18.63)μm,微孔径直径为(62.14±17.35)μm,孔隙率为97.70％±1.37％,吸水膨胀率为1 341.97％±64.41％.力学测试示,支架压缩至10％时,支架压缩位移为(0.376±0.004)mm、压缩应力为(0.016±0.002)MPa、弹性模量为(162.418±18.754)kPa.复合培养7、14d,两组HE染色及扫描电镜均见细胞在支架内部生长,主要分布在支架孔壁周围,其中实验组细胞较对照组增多,且细胞由梭形变为扁平状.除200倍镜下14d时两组细胞计数差异无统计学意义(t=-2.024,P=0.080)外,其余不同放大倍数(40、100、400倍)下各时间点实验组细胞数均显著高于对照组(P＜0.05).实时荧光定量PCR检测示:实验组培养7、14d时Ⅰ型胶原、OCNmRNA相对表达量显著高于对照组(P＜0.05),但BMP-2 mRNA相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).Western blot检测示,实验组培养7、14d时Ⅰ型胶原、BMP-2、OCN蛋白相对表达量均显著高于对照组(P＜0.05).结论 动态力学加载后,接种于三维仿生复合支架的MC3T3-E1细胞BMP-2、Ⅰ型胶原、OCN表达明显上调,表明适当力学载荷有利于MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化.

目的 建立一种适合乳腺癌肿瘤干细胞体外培养的三维培养体系.方法 根据不同的培养方法分为两组:二维细胞培养组,采用传统二维细胞培养方法培养乳腺癌MCF-7细胞;三维细胞培养组,将乳腺癌MCF-7细胞接种于三维胶原支架材料上,在摇床上动态培养5d,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下观察乳腺癌肿瘤细胞在胶原材料上的形态学特征.采用CCK-8细胞增殖检测的方法,比较三维培养组和二维培养组细胞增殖能力,通过流式细胞术检测两组乳腺癌肿瘤干细胞标志CD44+/CD24-/low的表达差异.结果 光学显微镜下观察结果显示:二维培养组MCF-7细胞为单层生长平展的粘附生长,呈多边形、铺路石样的上皮细胞形态;三维培养组MCF-7来源的细胞再次二维培养后,细胞展现出三角形或者长梭形及较多细胞呈不规则形,部分细胞还伸展出长浸润性伪足.激光共聚焦显微镜观察显示,MCF-7细胞均匀地生长在三维支架材料上,局部放大后清晰可见长伪足,且细胞大小不均一,细胞形态多样.三维培养组细胞增殖速度与二维培养组相似.与二维培养组相比较,三维培养组CD44+/CD24细胞比例显著增加,由38.9％增加至60.3％.结论 基于三维胶原支架材料的三维培养体系能够有效维持乳腺癌肿瘤干细胞干性.

背景:软骨损伤和缺损一直以来是困扰骨科和整形科医师的难题,组织工程为修复软骨缺损提供了新的途径.脂肪干细胞的来源充足、提取容易、损伤低、产量高、分离简单、增殖力强、具有多向分化潜能,因此成为软骨组织工程种子细胞的热门选择.目的:文章分析利用脂肪干细胞构建组织工程软骨的影响因素,总结验证脂肪干细胞向软骨细胞分化的方法,讨论构建组织工程软骨的主要瓶颈,并展望利用组织工程手段修复软骨缺损的研究方向.方法:于2017年6月5日在PubMed数据库中以"(((adipose stem cel[Title])OR adipose-derived stem cell[Title])OR adipose-derived mesenchymal stem cell[Title])AND chondrogenic differentiation[Title]"作为检索式检索.于2017年8月4日在SinoMed中以"("脂肪干细胞"[中文标题:智能])AND"软骨"[中文标题:智能]"作为检索式检索.通过标题及摘要选取与脂肪干细胞的向软骨细胞分化相关的文献,并阅读其参考文献的标题和摘要,从中再次选取与脂肪干细胞向软骨细胞分化相关的文献,剔除重复文献.结果与结论:检索符合条件文献35篇,其中近5年文献30篇.SinoMed中符合条件文献71篇,综述9篇,近5年文献22篇.最终纳入文献60篇.转化生长因子β、骨形态发生蛋白及胰岛素样生长因子等均可促进脂肪干细胞向软骨细胞分化,多种生长因子联合应用或将生长因子基因转染入脂肪干细胞,实现长效稳定缓释,是目前的研究热点之一.传统的地塞米松、胰岛素及维生素C,配合几种生长因子的成软骨分化诱导配方仍然是目前的主流诱导方法.利用细胞共培养、微球、支架、动态三维培养,均可有效提高组织工程软骨的构建效率和质量,但是寻找一种理想的支架材料依然是目前的主要问题.此外,细胞来源、培养条件、miRNA、富血小板血清及甲状旁腺素相关肽等也可影响脂肪干细胞向软骨细胞分化.除了细胞形态的改变之外,利用染色或对Sox9、Ⅱ型胶原蛋白、硫酸软骨素及硫酸角质素等软骨特异性基因和蛋白的检测,是验证脂肪干细胞分化为软骨细胞的可靠手段.未来的研究方向集中在寻找脂肪干细胞的特异性标记物,决定外源性生长因子联合应用的顺序和剂量,利用基因修饰种子细胞以及构建理想的支架材料上.

目的 在前期体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)向肝系细胞分化基础上,从细胞上皮间质转化(EMT)角度研究ESC分化为肝脏组织结构的可行性.方法 选用Balb/c小鼠ESC,首先利用肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等体外诱导ESC向肝系细胞方向分化,然后在分化中期(13 d)、成熟期(17 d)两个时间点动态抑制细胞Wnt/β-catenin信号以降低其EMT水平.最后在分化系统中观察分化细胞保持三维组织结构生长情况,检测其中肝系细胞和血管标志物白蛋白(ALB)、血管内皮生长因子(VEGFR)等表达情况,综合判断有无肝脏组织形成,并研究该过程中EMT水平变化的规律和机制.结果 ESC分化过程中,分化前期实验组EMT水平与对照组差别不明显,分化中、后期实验组EMT水平较对照组明显降低,分化第18天和20天,实验组上皮钙黏蛋白(E-cad)基因mRNA相对表达水平分别为0.61 ±0.15和0.47 ±0.05,对照组分别为0.07±0.05和0;实验组的ALB/AFP/CK8/CK19表达水平在同期内较对照组普遍偏高,标志物CD31/VEGFR1在分化中后期较对照组下降缓慢.在ESC培养上清液中,实验组ALB于第11天可检测到,浓度为(0.32±0.02) mg/L,而对照组ALB为(0.19 ±0.05) mg/L;实验组尿素于第13天开始检测到,浓度为(8.7±1.0)μmol/L,对照组尿素浓度为(3.1±1.2) μmol/L.ALB和尿素合成在ESC分化系统培养上清中浓度随分化时间延长而明显升高,并且实验组的ALB、尿素浓度值在相同的时间段内明显多于对照组.另外,实验组分化细胞可保持三维组织状态生长,对照组分化细胞最终呈单细胞状态.实验组可检测到肝系细胞标志物以及血管细胞标志物的表达,免疫荧光结果显示类肝细胞和血管结构紧密层状排列,HE染色提示有类肝小叶结构形成,而对照组无血管成分标志物表达.结论 ESC向肝系细胞分化中,在分化中、后期降低EMT水平,可有效促进ESC向肝脏组织结构分化.

神经系统精神疾病包含抑郁症、双相情感障碍、痴呆症、发育迟缓、精神分裂症等四百多种疾病,给个人、社会和国家带来了沉重的负担.虽然近年来对这些疾病的研究已经取得了巨大进展,但对这些疾病发生和发展机制仍然匮乏了解.随着诱导多功能干细胞技术的发展,越来越多的研究使用该技术动态模拟人类中枢系统疾病的进程和病理变化.该文介绍了诱导多功能干细胞技术并列举了其在神经精神疾病治疗中的应用.同时,该文也分析了干细胞三维培养技术并且提出了备受关注的热点研究问题.