基于荧光能量共振转移(Fluorescence energy resonance transfer,FRET)原理利用单壁碳纳米管(Single-walled carbon nanotubes,SWCNTs)构建一种操作简单、成本低、灵敏度高和选择性强的纳米生物传感器快速检测含有tst基因金黄色葡萄球菌.将tst基因互补序列设计为探针,利用单壁碳纳米管联合羧基荧光素(FAM)标记的DNA分子探针(FAM-P)构建出FAM-P/SWCNTs复合检测体系.考察该体系对靶标序列和靶标菌的灵敏度和特异性.结果表明,该生物传感器对靶标序列的检测下限低至10 nmol/L,并在10-100 nmol/L范围内具有较好的线性关系(R2=0.994),对靶标菌的检测下限低至102,且在102-107 CFU/mL范围内均呈现良好的线性关系(R2=0.999).此外,在错配实验和对非靶标菌检测时,该传感器呈现了较高的特异性.本研究构建的FAM-P/SWCNTs体系能快速检测含tst基因金黄色葡萄球菌,并具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点,为食品检测、临床诊断等领域开辟了新途径.

核糖体是蛋白质的“合成工厂”,也是临床上多种抗菌药物的作用靶点,因此,深入理解细菌核糖体的蛋白质翻译机制意义重大.蛋白质翻译是通过多步骤相互协调、多组分精细配合来实现高保真和精确调控.核糖体在mRNA上的移位作为翻译过程中最重要的事件之一,需要核糖体大规模的构象重排以及tRNA2-mRNA沿着核糖体的精确移动.在细菌中,移位是由延伸因子EF-G催化GTP水解来驱动的.近年来,单分子荧光共振能量技术(smFRET)的发展使得人们可以探究单个tRNA分子移位的动力学过程并实时观测核糖体的构象变化.本文首先介绍了smFRET技术的原理及特点,对其在核糖体结构动态及tRNA移位研究中的应用进行了较为系统的总结,并对其应用前景进行了展望.

[目的]圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)属于黄病毒科,是一种单股正链RNA病毒.黄病毒编码的非结构蛋白NS3在病毒复制以及多聚蛋白加工过程中起着重要作用,NS2B是其发挥作用的重要辅助因子.因此,NS2B-NS3蛋白酶复合物是抗病毒药物的重要靶标.本研究旨在构建SLEV NS2B-NS3蛋白酶的原核表达系统并建立其抑制剂的高通量筛选方法,从而发现其小分子抑制剂.[方法]通过PCR扩增SLEV NS2B-NS3蛋白的编码区,构建原核表达质粒;在大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代半乳糖苷(Isopropy1β-D-thiogalactoside)诱导得到可溶性的NS2B-NS3蛋白,并用镍亲和层析方法进行纯化;基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer)技术检测NS2B-NS3蛋白酶活性,建立其抑制剂的高通量筛选平台.[结果]SLEV NS2B-NS3蛋白酶纯化程度高达95％以上,基于酶活测定的抑制剂筛选平台准确可行.对700多个上市药物进行筛选后,发现原花青素对SLEV NS2B-NS3蛋白酶具有明显的抑制活性.[结论]本研究为SLEV NS2B-NS3蛋白酶抑制剂提供了一种操作方便、高通量的筛选方法,并首次发现了原花青素具有抑制SLEV NS2B-NS3蛋白酶活性的功能,可以作为治疗SLEV感染的潜在靶向药物.

蛋白质是动态的,在多种结构状态间转化.蛋白质的结构动态在时间和空间上跨越多个数量级,允许蛋白质执行特定生物学功能.细胞条件和细胞环境的变化会使蛋白质动态结构发生变化.因此,对蛋白质结构动态的全面表征可提供对蛋白质功能的机制的深入了解.在这里,我们综述了用于测定蛋白质系综动态结构和表征蛋白质结构动态变化的方法的最新发展.X射线晶体学、冷冻电镜和小角散射等技术可提供关于蛋白质特定状态或平均的结构信息,而核磁共振、荧光共振能量转移(FRET)和化学交联质谱等技术则提供了蛋白质结构域、蛋白质残基和原子之间的处于不同结构状态时的距离波动信息.尤其要指出的是,单分子水平的FRET测量能对蛋白质构象状态进行快速区分,而这样的信息会在其它测量中被掩盖.总之,不同的生物物理技术互为补充,只有通过它们的综合运用,才能清晰可见蛋白质结构和动态.

目的 为实现食品中17β-雌二醇(E2)污染物的超灵敏检测,本研究将适配体、分子信标和滚环扩增(RCA)技术相结合,用于E2的荧光检测.方法 E2能解旋由适配体和cDNA杂交生成的复合DNA,使cDNA游离并与环DNA特异性结合,在Phi29酶的作用下生成长单链DNA.长单链DNA与分子信标杂交后,解旋分子信标的发夹结构,使FAM荧光基团的荧光恢复,从而实现E2的超灵敏检测.结果 经过条件优化,在0.001ng/mL-10ng/mL的浓度范围内E2浓度与荧光强度呈现良好的线性关系:y=594.17LgC+3868.87(R2=0.9758),检出限为0.19 pg/mL.在牛奶和自来水中,加标回收率分别为81.33％-117.42％和89.25％-107.04％,相对标准偏差是2.02％-3.13％和1.09％-2.45％.结论 在本研究中,我们基于适配体技术和等温扩增技术提出了一种E2的超灵敏荧光检测方法.该方法灵敏度高、特异性强、操作简单、实验仪器要求低.该策略为E2的检测提供了一种新的方法,也为其他污染物的检测提供了新的思路.

目的 合成一系列含芳香基、直链取代基苯并硒唑,抑制A型肉毒毒素(BoNT/A)轻链活性,获得A型肉毒毒素(BoNT/A)的解毒剂.方法 以邻氨基苯甲酸甲酯为起始原料,经重氮化、酰氯化合成中间产物2?硒化苯甲酰氯,再与含不同取代基的芳香胺、直链胺反应合成一系列依布硒啉(ebselen)类及其他苯并硒唑衍生物.采用荧光共振能量转移法(FRET)测定各苯并硒唑衍生物对BoNT/A轻链的抑制活性,测定它们与谷胱甘肽(GSH)的反应性,以考察其与体内其他蛋白或含巯基分子的反应性,最后测定各抑制剂的体内解毒活性.结果 4?甲酸基、4?乙酸基取代依布硒啉的抑制轻链活性(IC50分别为0.81、0.42μmol/L)高于依布硒啉(IC50=1.31μmol/L)1～2倍;含丙酸基、甲基、乙基、氟、氯、溴、胺基、甲氧基、3,5?二甲氧基依布硒啉硒唑衍生物以及喹啉基、直链丁酸基及己酸基苯并硒唑活性降低(IC50为4.16～7.18μmol/L);而依布硒啉邻羧基衍生物、苯并咪唑硒唑的抑制剂活性显著下降(IC50>10μmol/L).GSH与含苯并咪唑硒唑、依布硒啉邻羧基衍生物反应较慢,其余均较快.2LD50的BoNT/A给毒1 h后,单次或多次给予20 mg/kg依布硒啉或其他苯并硒唑衍生物,苯并咪唑硒唑组可显著提高小鼠在72 h内的生存率.结论 在依布硒啉右侧苯环上连接甲酸基和乙酸基后能提升其对BoNT/A轻链抑制活性,并增加了水溶性,但不能提高体内活性,苯并咪唑硒唑可显著提高小鼠在72 h内的生存率.

在组蛋白H3K4甲基转移酶MLL3的催化结构域(MLL3SET)中定点引入非天然氨基酸N-炔丙基赖氨酸(N-propargyl-lysine,PrK),表达、纯化该突变蛋白(MLL3SET*),并评估突变蛋白的酶活,为后续进一步利用单分子荧光共振能量转移技术(smFRET)表征MLL3的作用机制奠定基础.将MLL3SET接入pET-28b(+)构建表达载体,通过MLL3SET晶体结构分析选择N4905位点进行PrK的引入;对商业化菌株(C321.ΔA.exp)进行基因组改造以引入T7 RNA聚合酶基因,并在改造后的菌株中表达、纯化MLL3SET*,最后测定MLL3SET*的酶活性.结果表明,在构建的C321.ΔA.exp lacZ::T7p07菌株中,pET28b-MLL3SET* 在共转入aaRS-tRNA正交系统以及外源添加PrK后能够正常表达;通过Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析成功纯化出高纯度的MLL3SET* 蛋白;多酶级联反应结果显示,MLL3SET* 的酶活性比野生型蛋白低,但仍具有约43％的甲基转移酶活性.本研究成功实现了含PrK的MLL3SET蛋白的原核表达与纯化,突变蛋白保留了一定酶活性,为后续深入研究MLL3的分子机制奠定了基础.