目的:探讨miR-181a在AR儿童血清中的表达,并分析miR-181a对AR患儿Treg细胞分化和功能的调控作用.方法:选择20例AR患儿和20例年龄相近,无过敏史的儿童为研究对象.Pearson相关分析外周血Treg数量与miR-181a表达之间关系.从AR患儿外周血中分离纯化Tregs.将miR-181a模拟物和抑制剂转染到Tregs细胞中.用流式细胞仪和ELISA法评价Tregs的功能.用卵清蛋白建立AR小鼠模型,然后通过功能增益和功能损失法确定miR-181a在AR中的作用.结果:与对照组相比,AR患儿外周血Treg数量减少,并且miR-181a表达显著降低.Pearson相关分析显示外周血Treg数量与 miR-181a表达呈显著正相关(R2=0.335,P＜0.001).miR-181a模拟物促进了 Tregs的增殖,并上调了 IL-10和TGF-β的mRNA表达.荧光素酶报告试验表明,miR-181a直接靶向OPN的3'UTR.在动物实验中,与AR和AR+miR-NC组相比,AR+miR-181a模拟组炎症减轻,AR+miR-181a抑制剂组炎症更严重.重组OPN蛋白显著逆转了 miR-181a模拟物的抗炎作用.此外,AR组小鼠Treg细胞明显减少,miR-181a模拟物显著增加了 AR小鼠的Treg细胞,而重组OPN蛋白显著逆转了miR-181a模拟物诱导的Treg细胞增多.结论:miR-181a的上调显著降低了 OPN的表达,进而减少了嗜酸性粒细胞和增强Treg功能,减轻了 AR发病过程中气道炎症的发生.

目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:利用超声靶向微泡破裂(UTMD)技术介导T细胞Itch基因沉默，观察T细胞免疫活性变化。方法:磁珠分选纯化T细胞，构建靶向Itch基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒。实验组为超声辐照＋Itch-shRNA质粒-SonoVue微泡，对照组为超声辐照＋阴性对照shRNA质粒-SonoVue微泡，空白组未处理。转染48 h，荧光显微镜和流式细胞术评估细胞转染效率，免疫印迹(Western blot)法检测Itch基因蛋白表达水平。转染72 h,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组细胞上清液中白介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)水平。采用单因素方差分析比较多组间差异，两两比较LSD- t检验。 结果:利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3%，转染后实验组、对照组和空白组Itch相对蛋白表达量分别为0.301±0.080、0.773±0.101和0.719±0.090，实验组Itch蛋白表达显著降低，差异有统计学意义( F＝24.441， P<0.01)。转染72 h，实验组、对照组和空白组IL-2浓度分别为(417.3±37.1)ng/L、(158.7±17.3)ng/L和(147.0±10.2)ng/L，差异有统计学意义( F＝118.701， P<0.001)；IFN-γ浓度分别为(168.3±12.1)ng/L、(74.3±3.7)ng/L和(74.6±7.1)ng/L，差异有统计学意义( F＝126.833， P<0.001)；实验组IL-2和IFN-γ表达水平较对照组和空白组显著升高。 结论:利用UTMD技术介导Itch-shRNA转染能明显降低T细胞Itch水平，增强T细胞免疫活性。

目的:探讨肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)和黏附素MrkD优势抗原表位融合蛋白对KP感染小鼠的免疫保护作用。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP ompA和mrkD序列，通过生信分析选取这两个蛋白的优势抗原表位，经融合聚合酶链反应(PCR)扩增表位序列后克隆至pColdI载体，并转入本科室保存的大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，Ni ＋层析凝胶纯化后获得重组蛋白rAD。rAD经皮下免疫22只BALB/c小鼠，同时设置22只佐剂对照组。完成免疫程序后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对小鼠血清中的抗体水平和脾脏体外抗原刺激后细胞因子分泌水平进行测定，并对小鼠鼻腔注射KP，观察免疫后的小鼠存活率和肺脏细菌数量。组间比较采用 t检验。 结果:分别扩增出ompA和mrkD抗原表位序列，并成功融合，融合片段大小为1 056 bp，与预测大小一致，克隆至pColdI载体后测序，测序正确。重组表达菌BL21(DE3)-pColdI-rAD经IPTG诱导后破碎收集上清纯化，获得可溶性rAD，大小为38.4×10 3，与预测大小一致。rAD 3次免疫BALB/c小鼠后，免疫组抗体滴度显著高于对照组(170 667.00±59 121.00比0.00±0.00， t＝5.00， P<0.01)。KP感染小鼠后，免疫组小鼠存活率显著高于对照组[(65.00±5.00)%比(0.00±0.00)%， t＝22.52， P<0.01]，免疫组小鼠肺脏细菌数显著低于对照组[(9 500.00±1 384.00) CFU比(87 833.00±25 365.00) CFU， t＝7.55， P<0.01]。脾细胞分离后经rAD刺激，免疫组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)分泌量均显著高于对照组[(115.70±17.21) pg/ml比(24.00±9.17) pg/ml， t＝8.14， P<0.01；(200.30±8.51) pg/ml比(9.00±3.00) pg/ml， t＝36.75， P<0.01；(92.33±6.11) pg/ml比(9.67±1.53) pg/ml， t＝22.73， P<0.01]。 结论:KP OmpA和MrkD优势抗原表位融合蛋白rAD，免疫BALB/c小鼠有助于对KP感染的抵抗。

目的:观察重症肌无力（MG）患者白细胞介素（IL）-36的表达，研究IL-36对MG患者调节性T细胞（Tregs）和Th17细胞的调控作用。方法:入组2016年7月至2021年8月新乡市中心医院就诊的MG患者51例（MG组）和健康对照者25名（对照组），采集外周血，分离血浆和外周血单个核细胞（PBMCs），采用酶联免疫吸附试验检测血浆IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36RA、IL-35、IL-17水平，流式细胞术检测Tregs和Th17细胞比例，实时定量聚合酶链反应法检测叉头盒蛋白3（FoxP3）和维甲酸相关孤独核受体γt（RORγt）mRNA表达。用重组IL-36β（5 ng/ml）刺激MG患者的PBMCs或纯化的Tregs，分析Tregs和Th17细胞比例、IL-35和IL-17分泌、FoxP3和RORγt mRNA表达、Tregs抑制活性的变化。结果:IL-36α、IL-36γ、IL-36RA水平在对照组和MG组之间的差异均无统计学意义（均 P>0.05）。MG组IL-36β水平高于对照组［（73.43±13.91）pg/ml比（60.91±12.65）pg/ml， t=3.79， P<0.001）。MG组Tregs比例［（4.67±1.33）%比（6.32±1.81）%， t=4.48， P<0.001］、IL-35水平［（50.06±7.93）pg/ml比（65.37±8.90）pg/ml， t=7.59， P<0.001］、FoxP3 mRNA（1.03±0.14比1.57±0.46， t=7.78， P<0.001）低于对照组，而Th17细胞比例［（1.05±0.15）%比（0.94±0.21）%， t=2.61， P=0.011］、IL-17水平［（40.61±13.13）pg/ml比（33.09±11.48）pg/ml， t=2.44， P=0.017］、RORγt mRNA（1.26±0.16比1.03±0.13， t=6.08， P<0.001）高于对照组（均 P<0.05）。上述指标在不同性别之间、早发型和晚发型之间、非胸腺瘤组和胸腺瘤组之间、不同Osserman分型之间的差异均无统计学意义（均 P>0.05），与定量重症肌无力（QMG）量表评分均无明显相关性（均 P>0.05）。重组IL-36β对MG患者PBMCs增殖无影响（ P=0.248），可降低Tregs比例［（3.05±0.66）%比（4.18±1.07）%， t=4.23， P<0.001］、IL-35分泌［（48.12±10.93）pg/ml比（56.96±13.73）pg/ml， t=2.36， P=0.023］和FoxP3 mRNA表达（0.99±0.17比1.18±0.13， t=4.01， P<0.001），但对Th17细胞比例、IL-17分泌和RORγt mRNA表达无影响（均 P>0.05）。重组IL-36β刺激的Tregs免疫抑制活性减弱，表现为细胞增殖升高［（0.83±0.12）×10 5个比（0.69±0.15）×10 5个， t=3.02， P=0.005］和IL-35分泌降低［（28.71±10.08）pg/ml比（37.12±10.47）pg/ml， t=2.39， P=0.023］。 结论:MG患者中升高表达的IL-36β可能主要通过抑制Tregs功能调控Tregs/Th17细胞平衡。

目的:建立猪带绦虫（Ts）14-3-3.2原核表达系统，并观察Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。方法:在遵义医科大学寄生虫学教研室前期获得Ts14-3-3.2基因序列的基础上，采用基于PCR的精确合成（PAS）方法全基因合成Ts14-3-3.2基因，经限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ双酶切后连接质粒pCzn1，构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2。将重组质粒转化至大肠埃希菌ArcticExpress感受态细胞中诱导表达，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析和鉴定表达产物，通过镍（Ni）柱亲和纯化获得纯化Ts14-3-3.2重组蛋白。采用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体，采用免疫印迹法（Western blot）检测Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。 结果:成功构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2，诱导表达后菌体上清液和沉淀均在相对分子质量约29.31 × 10 3处出现Ts14-3-3.2目的蛋白条带。纯化后带有His标签的Ts14-3-3.2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别，获得效价为1∶512 000的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Western blot结果显示，Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中均有表达。 结论:成功建立Ts14-3-3.2原核表达系统，获得了高纯度、高效价的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴阶段均有表达。

目的:观察慢性心衰患者中T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白-3（TIM-3）的表达及其对T细胞的调控作用。方法:收集2018年1至10月在郑州大学第一附属医院心血管内科住院治疗的慢性心衰患者86例（心衰组）和在郑州大学第一附属医院接受查体的健康对照32名（健康对照组），分离外周血单个核细胞，流式细胞术检测CD4 +T细胞和CD8 +T细胞中TIM-3的表达。分选CD4 + T细胞和CD8 +T细胞，使用抗TIM-3抗体刺激培养。酶联免疫吸附试验检测CD4 +T细胞培养上清中干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-4、IL-10、IL-35、IL-17、IL-22水平和CD8 +T细胞培养上清中肿瘤坏死因子（TNF-α）和IFN-γ水平，实时定量PCR法检测CD4 +T细胞中转录因子T-bet、GATA-3、FoxP3、RORγt和CD8 +T细胞中穿孔素、颗粒酶B mRNA相对表达量。组间比较采用 t检验或配对 t检验进行。 结果:心衰组TIM-3 +CD4 +T细胞比例高于健康对照组（3.47%±1.06%比0.92%±0.27%， P<0.001），心衰组TIM-3 +CD8 +T细胞比例亦高于健康对照组（6.12%±1.91%比1.77%±0.63%， P<0.001）。慢性心衰患者存在CD4 +T细胞和CD8 +T细胞功能不全，表现为心衰组CD4 +T细胞分泌IFN-γ、IL-17和IL-22水平低于健康对照组，分泌IL-10和IL-35水平高于健康对照组（均 P<0.05）。心衰组CD4 +T细胞中T-bet和RORγt mRNA相对表达量低于健康对照组（均 P<0.01），FoxP3 mRNA相对表达量高于健康对照组（1.93±0.88比0.97±0.28， P=0.031）。心衰组CD8 +T细胞分泌TNF-α和IFN-γ水平低于健康对照组（均 P<0.05），穿孔素和颗粒酶B mRNA相对表达量亦低于健康对照组（均 P<0.05）。抗TIM-3抗体刺激慢性心衰患者纯化的CD4 +T细胞，分泌IFN-γ、IL-17和IL-22水平高于无抗TIM-3抗体刺激（均 P<0.05），分泌IL-35水平则低于无抗TIM-3抗体刺激[（61±13）ng/ml比（72±17）ng/ml， P=0.029]。抗TIM-3抗体刺激后CD4 +T细胞中T-bet和RORγt mRNA相对表达量高于无TIM-3抗体刺激（均 P<0.05）。抗TIM-3抗体刺激慢性心衰患者纯化的CD8 +T细胞后，分泌TNF-α和IFN-γ水平高于无抗TIM-3抗体刺激（均 P<0.01），穿孔素和颗粒酶B mRNA相对表达量亦高于无抗TIM-3抗体刺激（均 P<0.05）。 结论:慢性心衰患者中T细胞表面TIM-3升高表达，TIM-3可能参与了慢性心衰患者T细胞功能不全的调控。

目的:初步探讨血清外泌体长链非编码RNA（lncRNA）对卵巢上皮性癌（卵巢癌）的诊断价值。方法:（1）收集2018年8月至2019年12月在广西医科大学附属肿瘤医院住院治疗的卵巢肿瘤患者，包括卵巢癌35例（恶性组）和卵巢良性肿瘤20例（良性组）；收集同期在本院体检的健康妇女15例（正常组）作为对照。抽取3组妇女的外周静脉血，采用商品试剂盒分离、纯化血清外泌体；外泌体的鉴定：透射电子显微镜观察外泌体的形态，NanoSight纳米颗粒分析技术分析外泌体的粒径分布，蛋白印迹（western blot）法检测外泌体的特异性标志蛋白分化群（CD） 63、CD 81、肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）的表达情况。（2）随机抽取恶性组中4例卵巢癌患者（恶性测序组）和正常组中3例健康妇女（正常测序组），采用高通量测序技术分析两组妇女的血清外泌体差异表达的lncRNA，并筛选出差异表达明显的lncRNA；实时荧光定量PCR技术验证筛选出的差异表达lncRNA在恶性测序组和正常测序组妇女血清中的表达，进一步扩大样本量（即恶性组、良性组、正常组共70份血清）验证筛选出的差异表达lncRNA在其中的表达。（3）绘制筛选出的差异表达lncRNA诊断卵巢癌的受试者工作特征（ROC）曲线，评价其敏感度和特异度等诊断效能；构建多因子联合诊断模型，通过logistic回归模型结合ROC曲线，评价其对卵巢癌发生的诊断效能。 结果:（1）透射电子显微镜观察，血清外泌体为脂质双层膜结构，一侧呈凹陷的半球形或杯托样；NanoSight纳米颗粒分析技术分析显示，外泌体颗粒的直径峰值为127.6 nm，直径30~150 nm的外泌体颗粒占58.9%；western blot法检测显示，与卵巢癌细胞系SKOV3细胞相比，血清外泌体的特异性标志蛋白CD 63、CD 81、TSG101蛋白的表达强度明显增强。（2）高通量测序技术分析显示，相对于正常测序组妇女，恶性测序组患者血清外泌体中筛选出差异表达lncRNA 425个（其中上调23个、下调402个）；挑选上调、下调表达异常明显的lncRNA 6个，即FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811、CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428，采用实时荧光定量PCR技术对恶性测序组和正常测序组妇女血清进行验证，其表达情况与测序结果一致。随后对这6个lncRNA进一步扩大样本量验证，恶性组患者血清外泌体中FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811的表达水平分别升高至良性组、正常组妇女的1.66、1.84倍，2.05、2.46倍，2.94、2.35倍，CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428的表达水平分别下降至良性组、正常组妇女的29%、34%，40%、46%，42%、42%，同一lncRNA的表达水平在恶性组与良性组、恶性组与正常组中分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.05），而良性组与正常组分别比较，差异均无统计学意义（ P均>0.05）。（3）6个差异表达lncRNA单独诊断卵巢癌的ROC曲线下面积（AUC）为0.722~0.805，具有中等诊断价值。联合因子预测模型1（包括FER1L6-AS2和LINC01811）、联合因子预测模型2（包括CXXC4-AS1、LINC02343和LINC02428）、联合因子预测模型3（包括FER1L6-AS2、CXXC4-AS1、LINC02343和LINC02428）的AUC分别为0.865、0.934和0.962，各联合因子预测模型的诊断效能均显著高于单一lncRNA的诊断效能（ P均<0.05）。 结论:经实时荧光定量PCR技术验证，高通量测序技术是筛选血清外泌体差异表达lncRNA的有效方法；血清外泌体多个lncRNA联合检测对卵巢癌患者的诊断效能显著高于单一lncRNA检测。检测血清外泌体lncRNA可为卵巢癌的诊断提供新的思路。

目的:采用RNA干扰技术下调DJ-1基因在肺鳞癌细胞HTB-182中的表达，采用串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术寻找DJ-1在HTB-182细胞系中的相互作用蛋白。方法:构建靶向DJ-1基因siRNA慢病毒载体，感染HTB-182细胞(DJ-1 siRNA组)，并设立慢病毒载体对照组(Control siRNA组)及空白对照组，采用Western blot法检测DJ-1蛋白表达水平，建立内源性的DJ-1蛋白表达沉默的si-DJ-1-HTB-182细胞。设计DJ-1的特异性引物，构建带有链霉素结合肽标签(SBP)、钙调蛋白结合肽标签(CBP)的DJ-1表达质粒pNTAP-DJ-1，用脂质体稳定转染细胞系DJ-1 siRNA HTB-182，G418筛选阳性克隆，Western blot进行验证，TAP-MS技术寻找DJ-1的相互作用蛋白。结果:DJ-1 siRNA干扰组中DJ-1的蛋白质表达明显低于空质粒(NC)组和空白对照(BC)组( P<0.05)；成功构建了稳定表达pNTAP-DJ-1质粒的HTB-182细胞系；TAP-MS筛选到DJ-1相互作用的三个蛋白质：细胞角蛋白1(Keratin 1)、细胞角蛋白10(Keratin 10)和NADPH氧化酶活化蛋白P47(P47 Px)。 结论:Keratin 1、Keratin 10和P47 Px可能是DJ-1蛋白的相互作用蛋白。

目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒，利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2，PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性，将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化，并对P1基因进行稳定性突变，构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量，离子交换层析纯化PV2-VLP，透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构，表明VLP成功组装。动物实验结果表明，重组制备的PV2-VLP具有免疫原性，且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗，为PV-VLP疫苗的研制提供参考。