目的:利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选诺如病毒(NoV)的抗原模拟表位.方法:包被与GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17型NoV具有高特异性及中和能力较强的单链可变片段抗体(scFv),用Ph.D.-12噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选.ELISA鉴定淘选所得噬菌体与scFv的结合活性及其与NoV P蛋白的竞争作用;阳性克隆测序后进行生物信息学分析,合成多肽鉴定其抗原性.结果:发现1段与GⅡ.6 VP1区同源性较高的氨基酸序列"MG-D-W",综合分析提示其可能为GⅡ.6 NoV的抗原模拟表位,且合成的包含"MG-D-W"的多肽可竞争抑制P蛋白与人类组织血型抗原(HBGAs)受体的结合.结论:"MG-D-W"是与NoV单链抗体高亲和力的肽段,可能模拟了GⅡ.6 NoV与scFv结合的抗原表位.

背景与目的 CD30-CART细胞现已应用于复发/难治性CD30阳性的经典霍奇金淋巴瘤(classical hodgkin lymphoma,cHL)患者中并取得一定疗效,但其疗效仍待进一步提高,本研究选择不同抗原表位的两种单克隆抗体Ki-4和Ber-H2,优化性构建不同CAR基因片段载体,探讨两种CART细胞对CD30阳性的cHL细胞L428的杀伤作用及其作用机制.方法 构建携带不同抗原表位的CD30-CAR基因片段的慢病毒载体,通过流式细胞检测技术比较两种不同抗原表位CART-30细胞对cHL细胞的杀伤作用,采用蛋白质免疫印迹法(western blotting,WB)分析不同抗原表位的CART-30细胞对cHL细胞NF-κB通路的调控作用.结果 成功构建了不同抗原表位的CD30-CART细胞,平均阳性率为65.7%.Ki-4组效靶比为1∶1时,杀伤效率平均值为(35.15±4.13)%(n = 6);效靶比为10∶1时,杀伤效率的平均值为(66.99±4.36)%(n = 6).Ber-H2组效靶比为1∶1时,杀伤效率的平均值为(31.95±3.11)%(n = 6);效靶比为10∶1时,杀伤效率的平均值为(56.11±2.73)%(n = 6).CD19组效靶比为1∶1时,杀伤效率的平均值为(21.92±2.14)%(n = 6);效靶比为10∶1时,杀伤效率的平均值为(45.49±5.31)%(n = 6).CIK组效靶比为1∶1时,杀伤效率的平均值为(16.99±0.79)%(n = 6);效靶比为10∶1时,杀伤效率的平均值为(32.22±2.11)%(n = 6)(P＜0.001).WB结果显示,TNF-α组及Ki-4的2 h和3 h组的磷酸化P65表达呈强阳性,IκBα蛋白表达呈弱阳性;而空白对照组、Ki-4的0 h组、Ber-H2各组的磷酸化P65和IκBα蛋白表达均呈弱阳性.结论 不同抗原表位的CD30-CART细胞对经典型霍奇金淋巴瘤细胞杀伤作用不同;Ki-4的单链可变区片段能有效激活NF-κB,但Ber-H2-CARs不能激活NF-κB.

单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)是由抗体重链可变区(variable region of heavy chain,VH)和轻链可变区(variable region of light chain,VL)通过柔性短肽连接组成的小分子,是具有完整抗原结合活性的最小功能片段,包含抗体识别及抗原结合部位.相比于其他抗体,scFv具有分子量小、穿透性强、免疫原性弱、易构建表达等优点.目前,scFv最常用的展示系统主要有噬菌体展示系统、核糖体展示系统、mRNA展示系统、酵母细胞表面展示系统和哺乳动物细胞展示系统等.近年来,随着scFv在医学、生物学、食品安全学等领域的发展,使得其在生物合成和应用研究方面备受关注.本文对近年来scFv展示系统的研究进展作一综述,以期为scFv的筛选及应用提供理论基础.

单链抗体(single-chain fragment variable,scFv)是由可变重链(VH)和可变轻链(VL)通过柔性肽接头连接在一起的小分子重组抗体.从杂交瘤中分离单链抗体的mRNA,逆转录成cDNA作为单链抗体基因扩增的模板,可得到包含大量不同VH和VL片段的单链抗体的基因文库.利用展示技术完成单链抗体亲和力和特异性筛选及鉴定,得到的单链抗体可通过各种表达系统成功表达单链抗体的蛋白质.虽然单链抗体分子量小,但已包含了完整抗体的抗原结合域,对抗原具有高特异性、高亲和力及低免疫原性,还具有较好的肿瘤组织穿透和扩散能力.因此,单链抗体已成为肿瘤诊疗方法开发中的研究热点.详细介绍了单链抗体的制备方法和问题,重点阐述了单链抗体在肿瘤诊断和治疗中的研究进展,以期为单链抗体制备及其治疗和诊断肿瘤提供理论依据.

过继性T细胞疗法在治疗癌症方面已显示出非凡潜力,特别针对B细胞恶性肿瘤.体外重定向工程T细胞主要使用2种不同策略.一种方法是向T细胞中引入全新设计的合成结构-嵌合型抗原受体(CAR),包含抗体片段(单链抗体scFv可变区)、跨膜结构域(带铰链/间隔区)和信号转导多重元件.另一种是利用T细胞受体(TCR)众所周知的能力:识别与主要组织相容性复合体(MHC)结合的特异性抗原肽,向T细胞中转入靶向癌症相关肽/人类白细胞抗原复合物(HLA)的TCR.虽然已有许多报道描述了这2种方法,但本综述重点关注最新进展.伴随早期成功,CAR也很快暴露出其合成结构亟待优化配置问题,而且对实体瘤的疗效还不理想.在诸多重要特征中,CAR抗原复合体大小和化学计量的重要性逐渐显现.最近,在TCR介导的突变多肽(新抗原)作为T细胞反应靶点的T细胞免疫治疗研究表明,新抗原也许能为TCR介导的过继性T细胞疗法提供新契机.

癌症是严重威胁人类生存的重大疾病.BiTE(bispecific T-cell engager)所代表的一类具有显著抗肿瘤效应的双特异抗体,能够靶向性激活自身T细胞杀伤肿瘤细胞.BiTE由两个单链可变片段(scFv)组成,通过柔性融合接头串联连接.一个scFv识别T细胞表面蛋白CD3ε,而另一个scFv识别特异性肿瘤细胞表面抗原.BiTE的这种结构和特异性结合蛋白能力允许它将T细胞物理性地桥接肿瘤细胞而形成T细胞-BiTE-肿瘤细胞复合物,诱导免疫突触形成,刺激T细胞活化,产生杀伤肿瘤的细胞因子.近年来,BiTE在抗肿瘤研究中取得了显著进展,在临床上取得了理想的治疗效果.因此,对BiTE的结构、作用机制、临床应用以及创新性运用进行阐述.

黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是一种毒性强、污染广的真菌毒素,建立高效、准确、快速的AFB1检测方法具有重要意义.利用噬菌粒-辅助噬菌体展示系统构建单链抗体(single chain variable fragment,scFv)文库,应用“淘选-洗脱”的策略,是筛选高亲和配体的常用方法之一.同时结合同源建模和分子对接等计算机辅助手段,分析得到抗体与抗原的结合位点与关键氨基酸,为在基因水平改造抗体提供基础.从AFB1-BSA免疫小鼠的脾细胞内扩增重链可变区和轻链可变区,将组合成的scFv片段插入噬菌粒pCANTAB5e中,构建了噬菌体展示单链抗体文库,以不同浓度的AFB1-OVA作为抗原,从文库中筛选到一株亲和力较好的抗AFB1单链抗体scFv,其亲和常数为8×105L/mo1;根据同源建模和分子对接发现,与抗原AFB1结合时,scFv中Tyr33、Ser52和Tyr102起关键作用,分别以π-π共轭键、氢键和范德华力与AFB1结合.

目的 建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术.方法 采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合成cDNA,以其为模板,IgG类抗体基因为引物,PCR扩增获得重链可变区片段(VH)和轻链可变区片段(VL),然后以VH和VL为模板,经重叠PCR获得scFv,经sfi Ⅰ酶切,插入pComb3xss载体,电转后获得一定容量的抗体库;加入辅助噬菌体VCSM 13过夜培养,上清液经PEG-NaC1沉淀,无菌PBS重悬噬菌体沉淀,即完成噬菌体抗体库的构建;采用Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定.结果 成功构建了库容为2.6× 109的噬菌体抗体库;随机挑选的100个噬菌体单克隆中共筛选到2个疑似H1N1株HA抗原的噬菌体抗体.结论 成功构建了噬菌体抗体库的技术平台,可用于各类功能抗体的筛选.

该研究探讨应用表达重组抗表皮生长因子受体三型变异体(EGFRvⅢ)的单链可变区片段(scFv)抗体的重组腺病毒感染骨肉瘤细胞,靶向抑制EGFRvⅢ活性后,骨肉瘤恶性生物学行为的变化情况.收获重组腺病毒,感染骨肉瘤细胞143B、MG63、TE85,靶向抑制EGFRvⅢ活性;体外通过MTT、结晶紫染色、划痕实验、细胞吸附、细胞Matrigel迁移等实验探讨骨肉瘤细胞增殖、黏附、迁移、侵袭等肿瘤恶性生物学行为的变化情况.体内通过感染骨肉瘤动物模型,靶向抑制EGFRvⅢ活性后,应用Xenogen imaging成像技术分析对肿瘤生长的影响.体外实验结果示,靶向抑制骨肉瘤EGFRvⅢ活性,可以明显下调肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭能力,逆转肿瘤恶性生物学行为;体内实验结果示,靶向抑制骨肉瘤EGFRvⅢ活性,可明显下调肿瘤细胞的增殖生长能力.靶向抑制EGFRvⅢ活性可能逆转骨肉瘤恶性生物学行为,其可能成为骨肉瘤治疗中极有希望的新靶点.

目的：:探讨降低鼠源性单克隆抗体（单抗）对人体的免疫原性。方法：:应用基因工程技术扩增出SZ-51重链和轻链可变区cDNA与连接肽（Gly 4Ser） 3的寡核苷酸片段进行拼接构建了表达载体pHEN1-51scFv，并导入大肠杆菌HB2151中进行表达。 结果：:其表达产物可折叠成可溶性并具有抗原结合能力的单链抗体（scFv，小分子肽）释放到细菌培养上清中。结论：:该分泌型小肽抗体能特异地与α-颗粒膜蛋白结合，具有与原鼠源单抗一致的抗原结合特性。