目的:制备全人源表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)单克隆抗体，为基于人EGFR靶点的肿瘤免疫调节治疗提供基础制剂。方法:采集110例胸部肿瘤(肺癌102例，乳腺癌8例)患者外周血，构建噬菌体单链抗体库。经噬菌体展示后筛选阳性克隆，测序并构建全长轻重链表达载体质粒，共转染HEK293。通过亲和层析获得纯化抗体，抗原抗体免疫反应测定抗体特异性和敏感性，生物膜干涉(biolayer interferometry，BLI)技术测定抗体亲和力和流式细胞技术(fluorescence activating cell sorter，FACS)检测对肿瘤细胞系EGFR结合活性。结果:成功构建肺癌单链抗体噬菌体库，抗体库库容≥10 8，筛选获得两株单抗，分别为BTHG17-1，BTHG17-2，酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定结合抗原敏感性为10 ng/mL，亲和力在10 －8 mol/L水平，两抗体结合相同表位，可特异性结合野生型EGFR和突变体EGFRvⅢ蛋白，具有结合肺癌和神经胶质瘤细胞活性。 结论:获得较高亲和力全人源EGFR单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)，具有EGFR(包括EGFRVⅢ)特异性，为EGFR靶点封阻和免疫导向治疗研究提供一种新抗体工具。

目的:探索靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的嵌合抗原受体(CAR)修饰的人外周血来源自然杀伤(NK)细胞在脑胶质瘤细胞中的杀伤作用。方法:通过Ficoll密度梯度离心法获得人外周血来源的NK细胞并进行体外扩增培养，并通过慢病毒感染构建靶向EGFRvⅢ的CAR-NK细胞及U87-EGFRvⅢ稳转细胞株。根据不同效应细胞作用于不同靶细胞而将实验组分为NK＋U87组、NK＋U87-EGFRvⅢ组、CAR-NK＋U87组、CAR-NK＋U87-EGFRvⅢ组，通过实时无标记细胞分析(RTCA)及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评价CAR-NK细胞对胶质瘤细胞的杀伤作用，同时使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、颗粒酶B(GzmB)以及穿孔蛋白1(PRF1)在细胞培养上清中的分泌情况。结果:流式细胞分析显示分离、培养得到的人外周血来源NK细胞的纯度为97.6%，存活率为98.2%；成功构建第二代靶向EGFRvⅢ的CAR分子，并成功构建靶向EGFRvⅢ的CAR-NK细胞，流式分析显示阳性细胞率为69.6%。RTCA结果显示靶细胞的生长曲线随时间呈上升趋势，过表达EGFRvⅢ的U87细胞增殖速率要高于U87细胞；在加入效应细胞后，细胞指数呈现下降趋势，在相同效靶比(E ∶T)下，CAR-NK＋U87-EGFRvⅢ组的细胞指数下降趋势快于NK＋U87-EGFRvⅢ组，且快于CAR-NK＋U87组。LDH释放实验进一步证明随着效靶比的增加，靶细胞的裂解率逐渐升高( FNK＋U87＝700.61、 FCAR-NK＋U87＝2 063.97、 FNK＋U87-EGFRvⅢ＝5 707.00、 FCAR-NK＋U87-EGFRvⅢ＝28 858.57，均 P<0.05)；在E ∶T＝2 ∶1及E ∶T＝3 ∶1时，NK＋U87-EGFRvⅢ组、CAR-NK＋U87组的细胞裂解率均低于CAR-NK＋U87-EGFRvⅢ组(均 P<0.05)。ELISA结果显示，TNF-α、IFN-γ、GzmB及PRF1的分泌量在相同组别内均随着效靶比的增加而增加(均 P<0.05)；在相同效靶比下，除了在E ∶T＝1 ∶1时，CAR-NK＋U87-EGFRv Ⅲ组较CAR-NK＋U87组GzmB分泌量的差异无统计学意义( P>0.05)；CAR-NK＋U87-EGFRvⅢ组分别与NK＋U87-EGFRvⅢ组、CAR-NK＋U87组相比，TNF-α、IFN-γ、GzmB、PRF1的分泌量均增高(均 P<0.05)。 结论:靶向EGFRvⅢ的CAR-NK细胞对EGFRvⅢ表达阳性的胶质瘤细胞具有较强的杀伤作用，其抗肿瘤能力优于NK细胞。

目的 探索靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的嵌合抗原受体(CAR)修饰的人外周血来源自然杀伤(NK)细胞在脑胶质瘤细胞中的杀伤作用.方法 通过Ficoll密度梯度离心法获得人外周血来源的NK细胞并进行体外扩增培养,并通过慢病毒感染构建靶向EGFRvⅢ的CAR-NK细胞及U87-EGFRvⅢ稳转细胞株.根据不同效应细胞作用于不同靶细胞而将实验组分为NK+U87 组、NK+U87-EGFRv Ⅲ 组、CAR-NK+U87 组、CAR-NK+U87-EGFRv Ⅲ 组,通过实时无标记细胞分析(RTCA)及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评价CAR-NK细胞对胶质瘤细胞的杀伤作用,同时使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、颗粒酶B(GzmB)以及穿孔蛋白1(PRF1)在细胞培养上清中的分泌情况.结果 流式细胞分析显示分离、培养得到的人外周血来源NK细胞的纯度为97.6％,存活率为98.2％;成功构建第二代靶向EGFRvⅢ的CAR分子,并成功构建靶向EGFRvⅢ的CAR-NK细胞,流式分析显示阳性细胞率为69.6％.RTCA结果显示靶细胞的生长曲线随时间呈上升趋势,过表达EGFRvⅢ的U87细胞增殖速率要高于U87细胞;在加入效应细胞后,细胞指数呈现下降趋势,在相同效靶比(E∶T)下,CAR-NK+U87-EGFRvⅢ组的细胞指数下降趋势快于NK+U87-EGFRvⅢ组,且快于CAR-NK+U87组.LDH释放实验进一步证明随着效靶比的增加,靶细胞的裂解率逐渐升高(FNK+U87=700.61、FCAR-NK+U87=2 063.97、FNK+U87-EGFRvⅢ=5 707.00、FCAR-NK+U87-EGFRvⅢ=28 858.57,均 P＜0.05);在 E∶T=2∶1 及 E∶T=3∶1 时,NK+U87-EGFRvⅢ组、CAR-NK+U87 组的细胞裂解率均低于 CAR-NK+U87-EGFRvⅢ 组(均 P＜0.05).ELISA结果显示,TNF-α、IFN-γ、GzmB及PRF1的分泌量在相同组别内均随着效靶比的增加而增加(均P＜0.05);在相同效靶比下,除了在 E∶T=1∶1 时,CAR-NK+U87-EGFRv Ⅲ组较 CAR-NK+U87 组GzmB分泌量的差异无统计学意义(P＞0.05);CAR-NK+U87-EGFRv Ⅲ组分别与NK+U87-EGFRvⅢ组、CAR-NK+U87组相比,TNF-α、IFN-γ、GzmB、PRF1的分泌量均增高(均P＜0.05).结论 靶向EGFRvⅢ的CAR-NK细胞对EGFRvⅢ表达阳性的胶质瘤细胞具有较强的杀伤作用,其抗肿瘤能力优于NK细胞.

本研究分析了共表达白细胞介素-15(interleukin-15,IL-15)和趋化因子配体19(C-C chemokine ligand 19,CCL19)的EGFRvⅢ CAR-T细胞的功能特性及其体外特异性杀伤效果,旨在优化CAR-T细胞多项功能,提高靶向 EGFRvⅢ 的 CAR-T细胞对胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)的治疗效果.通过基因工程技术获得重组慢病毒质粒,转染 293T 细胞获得慢病毒并感染 T 细胞获得靶向EGFRvⅢ的第四代CAR-T细胞(EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T).利用流式细胞仪、细胞计数仪、趋化小室、凋亡试剂盒等检测了第四代和第二代CAR-T细胞(EGFRvⅢ CAR-T)的CAR分子表达率、增殖、趋化能力、体外特异性杀伤能力及抗凋亡能力等.结果表明,与EGFRvⅢ CAR-T细胞相比,EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T细胞能成功分泌IL-15 和CCL19,具有更强的体外增殖能力、趋化能力以及抗凋亡能力(P值均<0.05),而体外特异性杀伤能力无显著差异.因此,靶向 EGFRvⅢ且同时分泌IL-15 和CCL19 的CAR-T细胞有望提高胶质母细胞瘤的治疗效果,为临床试验提供一定的参考依据.

目的 探讨黑骨藤对高表达表皮生长因子(EGF)受体突变体Ⅲ(EGFRvⅢ)的人胶质母细胞瘤细胞DKMG的影响及其机制.方法 取对数生长期的 DKMG 和不表达 EGFRvⅢ的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87MG,各自分为空白(Con)组(DMEM培养液)、低浓度黑骨藤组(100 mg/L黑骨藤培养液)、中浓度黑骨藤组(200 mg/L黑骨藤培养液)及高浓度黑骨藤组(400 mg/L黑骨藤培养液),处理细胞 24 h,采用细胞增殖与毒力检测试剂盒(MTS)检测各组DKMG、U87MG细胞的存活率,采用流式细胞术检测各组DKMG细胞凋亡率;实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qRT-PCR)检测各组DKMG细胞中EGFRvⅢ、B淋巴细胞瘤-2 基因(Bcl-2)及BCL2-Associated X(Bax)的信使核糖核酸(mRNA)表达,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组DKMG细胞中EGFRvⅢ、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋酶家族(Caspase-3、Cleaved caspase-3)蛋白的表达.结果 MTS检测显示,与Con组相比,各浓度黑骨藤组DKMG细胞存活率明显降低(P＜0.05),各浓度黑骨藤组U87MG细胞存活率比较、差异无统计学意义(P＞0.05);流式细胞术结果表明,与Con组比较,各浓度黑骨藤组DKMG细胞凋亡率明显增加(P＜0.05);qRT-PCR结果表明,与Con组比较,各浓度黑骨藤组DKMG细胞中EGFRvⅢ和Bcl-2 mRNA表达降低(P＜0.05),Bax 表达无变化(P＞0.05);Western blot 结果显示,各浓度黑骨藤组 DKMG 细胞中EGFRvⅢ、Bcl-2 及Caspase-3 蛋白表达下降(P＜0.05),Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表达升高(P＜0.05).结论 黑骨藤可诱发DKMG细胞凋亡,产生细胞杀伤作用,其机制可能与下调EGFRvⅢ、Bcl-2、Caspase-3 表达及上调Bax、Cleaved caspase-3 表达有关.

目的 通过对循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)的检测,探讨其在头颈部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck,HNSCC)中的意义.方法 收集2016年10月至2017年7月南京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科就诊的HNSCC病例,纳入24例作为试验组,其中男23例,女1例;年龄45 ～ 82岁;喉癌14例,下咽癌10例;TNM分期Ⅰ-Ⅱ期5例,Ⅲ-Ⅳ期19例;高分化鳞癌8例,中低分化鳞癌16例.所有24例均为初发和/或治疗后复发的HNSCC患者,均无并发其他部位的恶性肿瘤.纳入9名健康志愿者作为对照组.CTC检测利用一种新型的体内检测系统——CellCollector系统进行,治疗前对24例患者均进行了CTC检测,治疗后对16例患者进行18次检测,此16例患者最终均行手术治疗,对手术患者均在术后1周进行再次检测.其中对19例阳性CTC进行了EGFRvⅢ检测,2例阳性CTC进行了基因突变检测.利用SPSS 23.0软件对结果进行回顾性分析.结果 ①治疗前总捕获率70.8％ (17/24),其中Ⅰ-Ⅱ期捕获率40％ (2/5),Ⅲ-Ⅳ期捕获率78.9％(15/19);手术后总捕获率50％(8/16).对照组捕获率0.②CTC与患者年龄、性别、肿瘤位置、是否有淋巴结转移均无明显相关(P＞0.05).与肿瘤分期、肿瘤分化程度相关,差异有统计学意义(P＜0.05).③CTC中EGFRVⅢ阳性率为26.3％ (5/19);基因突变检测发现TP53、RB1、PIK3CA等基因突变.结论 CellCollector系统是检测CTC的一种非常高效的方式,CTC在HNSCC的发生、进展和转移中有重要的意义,通过对CTC的进一步研究,为HNSCC的早期发现、疗效检测、预后评估等方面提供依据.

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor-T,CAR-T),是通过体外激活和扩增肿瘤特异或非特异性杀伤细胞达到抗肿瘤效果,在肿瘤免疫治疗方面具有良好的应用前景.本研究构建靶向EGFRⅢ(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ)的嵌合抗原受体(CAR)的重组慢病毒表达载体,利用慢病毒感染并筛选能够稳定表达该嵌合抗原受体的Jurkat细胞系.通过EGFRvⅢ分子刺激、与U87MG细胞共培养的方式检测细胞系的活化状况.结果显示,成功构建了pCDH-EGFRvⅢscFv-CAR-copGFP-T2A-puro慢病毒表达重组质粒,并筛选出可稳定表达EGFRⅢ-CAR的Jurkat细胞系.CCK-8法检测显示,EGFRvⅢ分子刺激12h的Jurkat-CAR细胞增殖率约是对照组的1.36倍(P＜0.05);ELISA法检测显示,与U87MG细胞共孵育后,细胞上清中IL-2的浓度约是单独培养分泌在上清中IL-2的1.625倍(P＜0.01).以上结果表明,稳定表达CAR的iurkat细胞,可以靶向性识别EGFRvⅢ分子及EGFRvⅢ阳性的靶细胞,并引起IL-2细胞因子释放,为后续临床细胞免疫治疗提供了理论基础.

目的 探究表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)及血小板衍生生长因子-D(PDGF-D)在结肠癌组织中的表达及对靶向治疗的指导作用.方法 选取2016年1月2017年6月于我院行结肠癌根治术的患者60例,收集其标本作为观察组,另取正常结肠组织20例作为对照组.采用免疫组织化学技术及蛋白质印迹法检测组织中的EGFRvⅢ和PDGF-D,比较结肠癌和正常结肠组织中上述2指标的表达差异及影响表达的因素.结果 观察组EGFRvⅢ和PDGF-D的阳性表达率及含量均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).EGFRvⅢ和PDGF-D在结肠癌中的表达与性别和年龄无关,而同分化程度和临床病理分期(TNM)有关,分化程度低、TNM分期高的标本EGFRvⅢ和PDGF-D阳性表达程度及含量均高于分化程度高、TNM分期低的标本,差异均有统计学意义(P<0.05).EGFRvⅢ和PDGF-D在结肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.647,P<0.05).结论 EGFRvⅢ和PDGF-D在结肠癌组织中表达显著增加,且同分化程度和TNM分期有关.

探讨表皮生长因子受体(EGFR)及表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRv Ⅲ)在胆囊癌组织中的表达及临床意义.收集201 5年1月—2017年1月手术后胆囊癌组织标本67例、慢性胆囊炎组织标本60例,采用免疫组织化学染色检测2种组织标本中EGFR、EGFRv Ⅲ蛋白的表达水平,并分析两者与胆囊癌临床病理特征的关系.胆囊癌组织中EGFR蛋白、EGFRvⅢ蛋白的阳性表达率分别为56.72％、37.31％,胆囊炎组织标本中的EGFR、EGFRv Ⅲ蛋白的阳性表达率分别为21.67％、1.67％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);在低分化、Nevin分期Ⅲ+Ⅳ期、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期胆囊癌组织中EGFR蛋白的阳性率升高(P＜0.05);在发生淋巴结转移、低分化、Nevin分期Ⅲ+Ⅳ期、TNM分期Ⅲ +Ⅳ期胆囊癌组织EGFRv Ⅲ蛋白的阳性表达率升高(P＜0.05).胆囊癌组织中EGFR蛋白、EGFRv Ⅲ蛋白岛的阳性表达率增高,并且与肿瘤发生发展相关.

目的:制备靶向EGFRvⅢ的第三代CAR-T(EGFRvⅢ/3CAR-T),检测其在体外和体内对EGFRvI+ U87胶质瘤细胞的特异性杀伤效应.方法:用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染HEK293T细胞包装EGFRvⅢ/3CAR慢病毒(LV-EGFRvⅢ/3CAR),感染健康人CD3+T细胞,Western blotting和流式细胞术检测T细胞中EGFRvⅢ/3CAR的表达水平,51Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CAR-T对EGFRvⅢ+ U87细胞的体外杀伤效应,ELISA法检测EGFRvⅢ/3CAR+T的IFN-γ分泌水平.构建裸鼠异种胶质瘤移植模型,检测EGFRvⅢ/3CAR-T对移植瘤的体内杀伤活性.结果:EGFRvⅢ/3CAR慢病毒包装成功,滴度值为5×106 TU/ml.Western blotting在相对分子质量58 000处检测到EGFRvⅢ/3CAR表达,未转导组无相同分子量蛋白表达.流式细胞术检测结果显示EGFRvⅢ/3CAR转导效率平均为52.3％,51Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CAR-T特异性杀伤作用与E∶T值(E∶T为4∶1、为8∶1、16∶1、32∶1)呈正比关系.ELISA法检测到细胞因子IFN-γ分泌量为(1 836±148.2) pg/ml,与NTT和GFP+T细胞相比差异有统计学意义(P＜0.01).EGFRvⅢ/3CAR+T细胞的特异性杀伤活性及IFN-γ分泌均依赖于EGFRvⅢ在U87细胞中的表达水平.体内肿瘤生长检测结果显示,注射后3周EGFRvⅢ/3CAR+T组肿瘤体积较GFP+T细胞和PBS组差异有统计学意义(P＜0.01).结论:EGFRvⅢ/3CAR-T在体外和体内均能发挥靶向杀伤EGFRvⅢ+脑胶质瘤细胞的作用,为后续临床试验提供依据.