磁分离是从生物样本中富集特定目标物的常用方法.传统特异性磁分离方法一般通过将抗体与磁珠偶联获得免疫磁珠的方式用于特定目标物的捕获,但由于抗体有成本高、捕获目标物后不易释放等缺点,免疫磁珠难以满足众多研究领域对同时满足目标物大批量、高特异性富集的需求.核酸适配体同抗体一样具备目标物高特异性捕获的能力,相较抗体具有制备成本低、结构简单和化学稳定性高等优点,更适合用来大批量、高特异性富集特定目标物,因此在本研究中,本文利用石墨烯对单链和双链核酸的吸附能力不同的特性,以CD63适配体为例设计了一套可以将适配体展示于石墨烯表面并用于捕获、富集和释放目标物的方法.该设计主要包括2个单元,一是可以贴附于石墨烯表面并将CD63适配体展示于石墨烯外的双链寡核苷酸支架,二是采用与支架足部序列互补的单链寡核苷酸,将所捕获的目标物从石墨烯表面解吸附.本研究首先以氧化石墨烯(GO)纸为石墨烯界面,通过对支架或CD63蛋白等进行荧光标记,并对比支架释放前后及CD63蛋白捕获前后GO纸表面荧光强度变化表示其支架释放效果与CD63蛋白捕释情况,随后应用氨基修饰的石墨烯壳铁氮磁珠搭载CD63适配体双链支架,用于捕获细胞裂解液中CD63蛋白.结果表明,该支架可以将适配体展示于石墨烯表面捕获CD63蛋白并可以可控释放,使用挑选的改性石墨烯磁珠搭载该适配体双链支架,可以用于细胞裂解液中CD63蛋白的捕获.该方法有望实现多种蛋白质的特异性富集或通过捕获外泌体膜蛋白而富集外泌体等多种用途.

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种复杂的自身免疫疾病,传统治疗在部分重度和难治性患者中效果有限.近期研究显示,嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法在SLE治疗中展现出了具有前景的疗效.生物标志物在精准评估治疗效果和安全性方面至关重要,CAR T细胞治疗与安全性评估标志物包括传统标志物和与CAR T细胞疗法相关的标志物.传统的SLE病情监测标志物,仍可用于CAR T细胞治疗基线随访和病情监测,如血清抗双链DNA、抗单链DNA和抗核小体等自身抗体的滴度下降,血清补体水平恢复正常,以及尿蛋白/肌酐比值的改善,均提示病情得到有效控制.CAR T细胞疗效监测标志物分为B细胞和T细胞标志物.输注后,B细胞数量下降,B细胞表型以初始B细胞为主,记忆B细胞和浆母细胞的比例显著降低,表明治疗取得了疗效.输注前,初始T细胞(CD45RA+CD27+)和中央记忆型T细胞(CD45RA-CD62L+CD27+)的高比例则提示更强的抗肿瘤效应;患者的CAR T细胞表达与早期记忆分化相关的转录因子,如T细胞因子7和淋巴增强子结合因子1,提示这些患者对CAR T细胞疗法更为敏感.输注后,CD25、CD69和CD137等T细胞激活标志物,以及CD57、PD-1和Tim-3等耗竭标志物的高表达,提示T细胞的杀伤能力受到限制.CAR T细胞治疗安全性标志物不仅包括CAR T细胞分泌的效应细胞因子(如白细胞介素-2和IFN-γ),还包括单核细胞和巨噬细胞产生的细胞因子(如IL-1和IL-8),其水平可用于评估CAR T细胞疗法最常见的毒副反应[细胞因子释放综合征(cytokine release syn-drome,CRS)和免疫效应细胞相关神经毒性综合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome,ICANS)].高水平的血清巨噬细胞炎性蛋白1α对于预测CAR T细胞治疗后发生严重CRS和ICANS的风险具有较高的价值.此外,基线血小板计数和中性粒细胞绝对值可预测血液毒性,由IL-8、IFN-γ和IL-1β组成的感染相关预测模型,能够有效预测患者输注后出现严重感染的风险.CAR受体结构设计、清除淋巴细胞的化疗方式,患者曾接受的治疗选择及自身免疫状态等都会影响CAR T细胞治疗的疗效及安全性.在当前及未来将开启的相关临床研究中,应纳入全面、规范的检测和评估体系,为CAR T细胞疗法在SLE等自身免疫疾病的应用,提供比较标准.

目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤，酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性，流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能，Fortebio测定抗体亲和力，抗体全长测序，经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)；人EGFR单克隆抗体杂交瘤系，经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因，构建scFv，克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接，克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体，使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞，获得包装病毒，感染293V细胞，FACS测定CAR膜表达，ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况，转染激活人外周血T细胞，验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3，具备高度配受体封阻性能，经人源化改造后，亲和力稳定(2.67×10 －10 mol/L)，EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2)，其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后，细胞膜表面表达EGFR-scFv，检测培养上清存在PD-L1-ScFv；CTZ0431-2感染293V细胞后，细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达，双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体，EGFR-CAR中度结合亲和力，此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。

目的:融合穿梭肽和狂犬病单链抗体，优化在大肠杆菌中的表达条件，获得具有中和活性的重组穿梭肽-单链抗体。方法:重新编码SO57抗体序列，在N端融合Arg 12的穿梭肽，构建pET22(b)-rSO57表达载体，在大肠杆菌中重组表达。在菌体生长密度OD 600、诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度条件进行优化，获得较高的表达效果。使用固定化金属螯合层析对重组蛋白进行纯化，测定了重组单链抗体的相对亲和力，通过rSO57/CVS-11混合感染细胞和快速荧光灶抑制实验(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)，验证重组单链抗体的中和作用。 结果:rSO57构建成功，在 BL21(de3)中诱导表达，最优表达条件为菌体密度OD 600在0.8时，使用0.4 mmol/ml的IPTG诱导，16 ℃下诱导24 h，rSO57以可溶形式表达，表达量占到了菌体可溶性蛋白的19.8%。层析纯化后，获得了纯度为84%的重组rSO57。ELISA实验显示，rSO57的相对亲和力系数Ka＝4.3×10 5。当rSO57与CVS-11混合时，随着稀释的增加，细胞的感染率上升，表明重组抗体具有中和狂犬病病毒的能力。使用RFFIT进行测定，50 μg的rSO57相当于2.17IU的狂犬病中和血清。 结论:本实验重组表达了融合穿梭肽的重组单链抗体rSO57，且可以中和狂犬病病毒，以期制备可以用于狂犬病治疗的特异性和靶向性的抗病毒药物载体。

目的 探讨高龄复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)患者体液免疫状态.方法 采用回顾性研究方法,纳入2022年1月-2023年10月在本中心就诊的RSA患者,检测其多种自身抗体,采用多因素logistic回归方法,在控制体质量指数(body mass index,BMI)、既往活产史、自然流产次数三个混杂因素的基础上,比较不同年龄分组(低龄组20～34岁,高龄组35～45岁)与多种自身抗体之间的关联,进而探讨高龄RSA女性与低龄RSA女性体液免疫状态差异.结果 共纳入4 008例RSA女性,其中高龄组1 158例,低龄组2 851例.高龄组和低龄组抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿性关节炎、未分化结缔组织病的患病率分别为15.6%和14.1%、0.0%和0.1%、0.9%和0.9%、0.3%和0.0%、23.7%和22.6%,两组比较差异无统计学意义.高龄组和低龄组抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies,aPLs)阳性率分别为19.1%和19.5%,抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)阳性率分别为6.6%和6.6%,抗可提取核抗原(extractable nuclear antigen,ENA)抗体阳性率分别为9.2%和10.5%,抗双链DNA(anti-double stranded DNA,dsDNA)抗体阳性率分别为2.0%和2.0%,抗单链DNA(anti-single-stranded DNA,ssDNA)抗体阳性率分别为2.2%和1.2%,抗α-胞衬蛋白抗体(antibodies against alpha-fodrin,AAA)阳性率分别为5.1%和4.9%,甲状腺自身免疫(thyroid autoimmunity,TAI)分别为17.8%和16.8%,两组比较差异均无统计学意义,高龄组中狼疮抗凝物(lupus anticoagulant,LA)阳性率为1.6%,低龄组为2.7%,差异有统计学意义(校正的优势比=0.36,95%置信区间:0.17～0.78).4 008例RSA患者中aPLs谱中三种抗体累计阳性778例,其中抗β2糖蛋白Ⅰ抗体(anti-β2 glycoprotein Ⅰ antibodies,β2GPⅠ Ab)-IgG/IgM阳性者520例,aCL-IgG/IgM阳性者58例,LA阳性者73例,β2GPⅠ Ab-IgG/IgM与aCL-IgG/IgM同时阳性者105例,β2GPⅠ Ab-IgG/IgM与LA同时阳性者17例,aCL-IgG/IgM与LA同时阳性者2例,三种抗体均阳性者3例.结论 本研究未发现高龄RSA患者与低龄RSA患者体液免疫状态存在差异.

[目的]开发一种新型DNA测序酶,解决一代测序技术应对复杂DNA结构模板所面临的主要挑战,如测序信号中断或测序信号快速衰减.[方法]从NCBI数据库中挖掘到了Taq DNA聚合酶和单链结合蛋白SSB基因信息,利用遗传融合、定点突变及基因设计技术获得了一种新型的测序酶Sso-Sequenase.利用亲和层析和离子交换层析,获得了纯化的测序酶.利用抗体修饰技术改良了Sso-Sequenase的性能,并且利用STR技术对其热启动性能进行了表征.选取多组不同类型的复杂模板,采用一代技术对比分析了Sso-Sequenase测序酶试剂盒和传统BigDye测序试剂盒的测序表现.[结果]Sso-Sequenase在大肠杆菌中稳定表达,纯度达到 95%以上,产量高达 10.5 mg/L.当温度低于 35℃时,Sso-Sequenase表现出热启动活性.在复杂模板的一代测序反应中,如重复序列、高GC和发夹结构等样本,Sso-Sequenase测序酶成功完成了所有样本的测序,序列的平均碱基质量QV大于 20.相比而言,BigDye测序试剂盒在处理这些复杂样本时,多数样本测序信号出现了显著衰减或中断.[结论]开发了一种纯度好、产量高,兼具热启动活性的DNA测序酶Sso-Sequenase及测序试剂盒,显著提高了复杂DNA结构模板(重复序列、高GC和发夹结构)测序成功率.

目的:从发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)恢复期患者的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中,获得大别班达病毒(Dabie bandavirus,DBV)特异性抗体序列,制备全人源DBV抗体.方法:用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测恢复期患者血浆抗体效价,挑取恢复期患者PBMC样本进行磁珠富集,经流式细胞仪分选获得能够结合DBV糖蛋白的特异性单个B细胞,经B细胞受体(B cell receptor,BCR)测序获得抗体序列,进行单链抗体的原核表达,采用蛋白免疫印迹、ELISA和体外中和实验鉴定抗体的表达、结合能力和中和活性.结果:共收集25例SFTS恢复期患者血液样本,血浆中均发现了 DBV糖蛋白和核衣壳蛋白的抗体.选取样本进行流式分选和BCR测序,分析后共获得6个单链抗体,对DBV均具有良好的结合能力和中和活性.结论:成功表达了 6个与DBV具有中和作用的全人源抗DBV抗体.

目的 本研究拟构建大容量天然鸡源噬菌体单链抗体库,用于传染病诊断用抗体筛选.方法 选取未经免疫的5周龄白来航鸡包括普通级别和无特定病原体级别、罗曼鸡、洛岛红鸡、洛岛白鸡和贵妃鸡,每个品种各5只,共30只.从法氏囊中提取总RNA,通过反转录合成cDNA.利用聚合酶链式反应技术扩增全套编码抗体可变区的基因序列.通过重叠延伸反应,将重链可变区和轻链可变区基因连接成为单链抗体.将经过回收并酶切纯化的单链抗体克隆到噬菌体载体上,电转化大肠埃希菌TG1感受态细胞.结果 成功构建库容量达1010的鸡源天然单链抗体库细胞库,噬菌体展示库滴度达1012菌落形成单位/mL以上.随机挑选165个单克隆进行菌落PCR鉴定,转化阳性插入率为96.97％(160/165);随机选取72株阳性克隆进行测序,抗体互补决定区3碱基序列及长度存在显著差异,表明构建的抗体库多样性良好.结论 本研究成功构建了大容量鸡源天然单链抗体库,为后续从中筛选出具有应用价值的特异性单链抗体奠定了基础.