目的:检测双硫仑/铜复合物(DSF/Cu)联合多柔比星对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响并探讨其作用机制。方法:以浓度5.000、2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.019、0.009 μmol/L的多柔比星及相同浓度梯度的DSF/Cu(Cu 2＋固定浓度1 μmol/L)分别处理HepG2细胞，噻唑蓝(MTT)法计算多柔比星和DSF/Cu对HepG2细胞的半抑制浓度(IC 50)。以上述浓度梯度的多柔比星单独及联合0.15 μmol/L的DSF/Cu处理HepG2细胞，MTT法分析单用多柔比星及联合DSF/Cu对HepG2细胞增殖的影响，CompuSyn软件计算两药作用的联合指数(CI)。将HepG2肝癌细胞分为未处理组(不添加任何药物)、二甲基亚砜(DMSO)处理组(仅加入与DSF/Cu处理组等量的DMSO)、DSF/Cu处理组(IC 50浓度的DSF/Cu处理)、多柔比星处理组(IC 50浓度的多柔比星处理)、多柔比星＋DSF/Cu处理组(IC 50浓度的多柔比星及DSF/Cu联合处理)，以流式细胞技术检测各组HepG2肝癌细胞中ALDH ＋细胞数量的改变，干细胞成球实验检测各组HepG2肝癌细胞成瘤性的改变，蛋白质印迹法(Western blot)检测各组HepG2肝癌细胞中人表皮生长因子受体2(Her-2)、性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、c-Myc、LC3-Ⅱ/Ⅰ和裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved PARP)蛋白的表达。组间两两比较采用配对样本 t检验，组间多个均数比较采用单因素方差分析。 结果:多柔比星和DSF/Cu对HepG2肝癌细胞作用48 h的IC 50分别为0.869 8、0.553 8 μmol/L。多柔比星联合0.15 μmol/L的DSF/Cu对HepG2肝癌细胞的增殖抑制作用明显强于单用多柔比星( t＝8.930， P<0.01)，CompuSyn分析显示多柔比星联合DSF/Cu对HepG2肝癌细胞的增殖抑制呈协同作用(CI<1)。流式细胞分析显示，DSF/Cu处理组[(0.886±0.082)×10 5]和多柔比星处理组[(1.374±0.041)×10 5]HepG2肝癌细胞中ALDH ＋细胞数量低于未处理组[(1.859±0.979)×10 5]，差异有统计学意义( t＝10.800、6.444， P<0.05)。多柔比星＋DSF/Cu处理组[(0.306±0.122)×10 5]HepG2肝癌细胞中ALDH ＋细胞数量明显低于DSF/Cu处理组和多柔比星处理组，差异有统计学意义( t＝5.590、11.730， P<0.01)。干细胞成球实验显示，DSF/Cu处理组(2.167±1.169)和多柔比星处理组(21.170±4.875)中HepG2肝癌干细胞球体数量少于未处理组(46.500±5.357)，差异有统计学意义( t＝19.800、8.567， P<0.05)。多柔比星＋DSF/Cu处理组(0.833±0.753)中HepG2肝癌干细胞球体数量少于多柔比星处理组(21.170±4.875)，差异有统计学意义( t＝10.100， P<0.01)。而与DSF/Cu处理组(2.167±1.169)比较，多柔比星＋DSF/Cu处理组(0.833±0.753)干细胞球体数量差异无统计学意义( t＝2.349， P>0.05)。Western blot结果显示，DSF/Cu处理组和多柔比星＋DSF/Cu处理组HepG2肝癌细胞中Her-2、SOX9、c-Myc蛋白的表达低于未处理组(0.132±0.013比0.049±0.010比0.950±0.052、0.325±0.049比0.311±0.038比0.922±0.027、0.308±0.041比0.235±0.027比0.816±0.092， F＝412.50、113.20、47.54， P<0.05)，而LC3-Ⅱ/Ⅰ和Cleaved PARP蛋白表达高于未处理组(1.527±0.201比2.629±0.224比0.766±0.159、0.906±0.083比0.834±0.058比0.039±0.001， F＝35.15、170.40， P<0.05)。多柔比星处理组HepG2肝癌细胞中Her-2和SOX9蛋白的表达低于未处理组(0.275±0.018比0.950±0.052、0.535±0.034比0.922±0.027， t＝17.440、12.680， P<0.05)，但c-Myc、LC3-Ⅱ/Ⅰ和Cleaved PARP蛋白的表达与未处理组比较差异无统计学意义(0.914±0.097比0.816±0.092、1.329±0.152比0.766±0.159、0.063±0.017比0.039±0.001， t＝1.042、4.205、2.061， P>0.05)。多柔比星＋DSF/Cu处理组中c-Myc、Her-2和SOX9蛋白的表达低于多柔比星处理组(0.235±0.027比0.914±0.097、0.049±0.010比0.275±0.018、0.311±0.038比0.535±0.034， t＝9.579、15.520、6.222， P<0.05)，而LC3-Ⅱ/Ⅰ和Cleaved PARP蛋白表达高于多柔比星处理组，差异有统计学意义(2.629±0.224比1.329±0.152、0.834±0.058比0.063±0.017， t＝6.800、17.980， P<0.05)。 结论:双硫仑/铜复合物联合多柔比星能够协同抑制HepG2肝癌细胞的增殖，其机制可能与抑制HCSCs及干性基因相关蛋白并诱导肝癌细胞发生自噬和凋亡有关。

背景:研究表明双硫仑本身具有抗肿瘤活性,可联合铜(Cu)离子在体内外水平对多种肿瘤发挥抑癌作用,但关于双硫仑对骨肉瘤细胞增殖和凋亡作用的影响尚未阐明.目的:探讨双硫仑-Cu在体内外水平对骨肉瘤增殖与凋亡能力的影响以及可能的作用机制.方法:实验方案经山西医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号为2017LL077).①体外实验:配置双硫仑在进入人体后的转换物二乙基二硫代氨基甲酸钠(diethyldithiocarbamate,DDTC)和Cu离子的复合物DDTC-Cu(0.5,1,2,3和5μmol/L),设置DDTC单药(5μmol/L)、Cu单药(5μmol/L)和空白对照组.药物处理人骨肉瘤细胞Saos-2细胞和MG-63细胞,CCK8法检测不同浓度DDTC-Cu对Saos-2细胞和MG-63细胞的增殖抑制作用;采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测DDTC-Cu对Saos-2细胞凋亡水平变化;②体内实验:取4周龄BALB/c-nu/nu雌性裸鼠共10只,随机分为DDTC-Cu组和对照组.采用异位移植方法,在裸鼠右侧背部皮下注射Saos-2细胞和Matrigel混悬液(1:1混合),注射量400μL/只;接种2周后,对照组裸鼠腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg,隔日1次),DDTC-Cu组裸鼠腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg,隔日1次)和DDTC-Cu复合物(10 nmol/g,隔日1次);观察两组荷瘤小鼠移植瘤生长情况,绘制瘤体生长曲线.接种5周后麻醉下处死动物,完整取出瘤体,免疫组织化学检测瘤体石蜡切片组织中ki67蛋白的表达水平,Western blot检测瘤体组织中细胞增殖和凋亡蛋白的表达及JNK通路蛋白表达的变化.结果与结论:①体外实验结果:DDTC-Cu组对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用明显高于其他3组;CCK-8实验结果显示DDTC-Cu对骨肉瘤细胞增殖抑制呈剂量依赖性,两株细胞的24 h药物半抑制浓度分别为0.337μmol/L和0.487μmol/L;流式细胞学检测结果显示DDTC-Cu可呈剂量依赖性促进Saos-2细胞的凋亡;②体内实验结果:DDTC-Cu组裸鼠移植瘤的体积和质量均小于对照组;免疫组织化学结果显示,DDTC-Cu组的瘤体中ki-67蛋白表达水平较对照组降低;Western blot检测结果显示,DDTC-Cu组瘤体蛋白中p-JNK和c-jun的表达水平均上调.结果提示,双硫仑联合Cu离子在体内外水平抑制人骨肉瘤细胞增殖并促进骨肉瘤细胞凋亡,其作用机制可能与JNK通路活化有关.

目的 研究双硫仑/铜复合物二乙基二硫代氨基甲酸铜[copper(Ⅱ)diethyldithiocarbamate,CuET]对肝癌细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法 用不同浓度(0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 μmol/L)的CuET处理,CuET(2.00 μmol/L)作用不同时间(0、3、6、9、12、24 h)或Drp1线粒体转位的选择性抑制剂Mdivi-1(1.00 μmol/L)预处理肝癌细胞HepG2、SMMC-7721后,MTT实验检测细胞存活率,软琼脂克隆形成实验确定集落形成,流式细胞术分析细胞凋亡,激光共聚焦检测Drp1线粒体转位,Western blot检测细胞凋亡的相关蛋白cleaved-Caspase 9、cleaved-Caspase 3、cleaved-PARP 1、细胞色素C(cytochrome C,cyto C),以及线粒体分裂蛋白phospho-Drp1(S637)、phospho-Drp1(S616)和Drp1的表达.结果 CuET对HepG2和SMMC-7721细胞增殖和集落形成的抑制作用呈剂量依赖性(P＜0.01);对HepG2和SMMC-7721细胞凋亡诱导作用也有明显的剂量和时间依赖性(P＜0.01);Western blot检测结果显示,CuET可导致Caspase 3 和Caspase 9的裂解激活,PARP的降解激活以及cyto C从线粒体向细胞质的释放.CuET处理可导致Drp1(S637)去磷酸化和Drp1线粒体转位.细胞经Mdivi-1预处理后可明显阻断CuET诱导的Drp1线粒体转位、Caspase 3的裂解/激活、cyto C的释放以及细胞凋亡.结论 双硫仑/铜复合物通过Drp1去磷酸化和线粒体转位抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞发生凋亡.