目的:观察叶下珠复方Ⅱ号(CPUⅡ)对肝癌Huh7细胞增殖以及叶下珠复方Ⅱ号对胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)信号通路转录的影响,探讨叶下珠复方Ⅱ号抗肝癌作用机制.方法:采用小分子干扰RNA技术(siRNA)转染肝癌Huh7细胞,构建抑制IGF-1R的肝癌Huh7细胞(anti-IGF-1R Huh7),选择稳定表达的抑制IGF-1R的肝癌Huh7细胞,将肝癌Huh7细胞以及抑制IGF-1R的肝癌Huh7细胞分别分为4组:空白组,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(3.0,1.5 g·L-1)以及5-氟尿嘧啶(5-FU)组(0.03 g·L-1),采用噻唑蓝(MTT)比色法测定药物对各组细胞增殖的影响,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)以及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测IGF-1R以及其下游相关指标mRNA及蛋白表达.结果:与空白组比较,转染(SASI_Hs01_00126196及SASI_Hs01_00126196_AS)序列肝癌Huh7 IGF-1R mRNA及蛋白表达量最低,选择该细胞进行实验.MTT比色实验结果表明,与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号能够抑制Huh7细胞以及抑制IGF-1R的肝癌Huh7细胞增殖,并且siRNA抑制IGF-1R基因表达后,叶下珠复方Ⅱ号还能继续抑制Huh 7细胞增殖,且IGF-1R,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶3(Akt3) mRNA表达量进一步下降(P＜0.05).结论:叶下珠复方Ⅱ号能够抑制Huh7细胞增殖,作用机制可能是抑制IGF-1R及其下游mRNA转录有关.

目的:观察叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞增殖、凋亡与自噬的影响,进一步探讨其抗肝癌的作用机制.方法:体外培养肝癌Huh7细胞,设空白组,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(40,20 g·L-1)和5-氟尿嘧啶(5-FU) (0.04 g·L-)组,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞增殖的影响,流式细胞仪检细胞凋亡变化,单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察药物作用后细胞自噬体的变化,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶2(Akt2),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)mRNA表达的改变,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Akt2和LC3Ⅱ蛋白表达的变化.结果:叶下珠复方Ⅱ号(40,20 g·L-1)可显著抑制肝癌Huh7细胞,并诱导其凋亡,凋亡率分别为51.72％,19.74％,显著高于空白组(P＜0.01).采用MDC染色后,叶下珠复方Ⅱ号(40,20 g·L-1)组可见大量自噬体的形成.与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组PI3K,Akt2,Bcl-2 mRNA表达均显著下降,LC3ⅡmRNA表达均显著增加(P＜0.01).与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号(40,20 g-L-1)组处理后的Akt2蛋白表达显著下降,LC3Ⅱ蛋白表达明显增加(P＜0.05,P＜0.01).结论:叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞增殖有明显的抑制作用,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路活化从而诱导细胞凋亡和自噬有关.

目的 观察叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞miR-122表达及胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)信号通路的影响,探讨其抗肝癌作用机制.方法 采用反义寡核苷酸技术(siRNA)建立miR-122表达抑制肝癌Huh7细胞株(anti-miR-122-Huh7细胞).体外培养Huh7、anti-miR-122-Huh7细胞,分别设置对照组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(3.0 mg·mL-1)和低剂量组(1.5 mg·mL-1).采用噻唑蓝(MTT)比色法检测2种细胞增殖;流式细胞术检测anti-miR-122-Huh7细胞调亡;采用qRT-PCR法和Western Blot法分别检测miR-122及其转录因子C/EBPα、靶基因IGF-1R及下游AKT3、KRAS、ERK1和CyclinG1基因表达.结果 与肝癌Huh7细胞比较, anti-miR-122-Huh7细胞miR-122的表达显著下降、靶基因IGF-1R蛋白表达明显升高(P<0.05),miR-122表达抑制肝癌Huh7细胞构建成功.与对照组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组作用于肝癌Huh7细胞后,可以显著上调miR-122的表达(P<0.05),并下调IGF-1R mRNA的表达(P<0.05);叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组均可显著抑制Huh7、anti-miR-122-Huh7细胞的增殖(P<0.05),且对anti-miR-122-Huh7细胞抑制作用更为明显(与Huh7细胞比较,P<0.05).与对照组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组作用于anti-miR-122-Huh7细胞后,细胞晚期凋亡率及总凋亡率均显著升高(P<0.05);高剂量组的miR-122表达及miR-122的上游转录因子C/EBPα的mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05);高、低剂量组的IGF-1R及下游AKT3、KRAS、CyclinG1基因的mRNA、蛋白表达均显著下调(P<0.05),且ERK1蛋白表达亦明显下调(P<0.05).结论 叶下珠复方Ⅱ号可能通过提高miR-122的表达,抑制IGF-1R信号通路活化,从而抑制肝癌Huh7细胞增殖和促进其凋亡.

目的:探讨叶下珠复方Ⅱ号通过抑制长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)的表达,恢复小分子RNA let-7a(microRNA let-7a)的表达,从而发挥抗肝癌的作用机制.方法:应用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测正常肝细胞LO2与肝癌HepG2细胞lncRNACCAT1的表达,比较2种细胞的表达差异.采用噻唑蓝(MTT)比色法测定肝癌HepG2在不同浓度的叶下珠复方Ⅱ号与5-氟尿嘧啶(5-FU)作用24,48,72 h后细胞增殖的情况.体外培养肝癌HepG2细胞,设空白组,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(1.6,08g·L-1),应用Real-time PCR检测各组lncRNA CCAT1,microRNA let-7a和其靶基因高迁移率蛋白A2(HMGA2),N-RAS基因(N-RAS)mRNA表达改变;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组HMGA2和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的蛋白表达.结果:与LO2细胞比较,肝癌HepG2细胞lncRNA CCAT1的表达明显上调(P＜0.05).通过MTT比色实验测定出叶下珠复方Ⅱ号和5-FU作用于肝癌HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为1.649,0.044 648 g·L-1;与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(1.6,0.8 g·L-1)均可抑制肝癌HepG2细胞增殖(P＜0.05),叶下珠复方Ⅱ号高质量浓度组(1.6 g·L-1)最为显著.Real-time PCR结果显示,与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(1.6,0.8g·L-1)lncRNACCAT1的表达明显抑制(P＜0.05),高质量浓度组microRNA let-7a表达明显上调(P＜0.05),叶下珠复方Ⅱ高、低质量浓度组HMGA2 mRNA表达均明显下调,高质量浓度组N-RAS mRNA表达明显下调(P＜0.05).Western blot结果表明,与空白组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低质量浓度组(1.6,0.8 g·L-1)的HMGA2,CyclinD1蛋白表达均明显下调(P＜0.05).结论:叶下珠复方Ⅱ号可以通过抑制HepG2细胞lncRNACCAT1表达,恢复microRNA let-7a表达,并抑制其下游相关靶基因的mRNA和蛋白表达,进而抑制肝癌细胞增殖,发挥抗肝癌作用.

目的 观察叶下珠复方Ⅱ号对miR-122低表达肝癌Huh7细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用,并探讨其作用机制.方法 将采用siRNA技术建立的miR-122低表达肝癌Huh7细胞(anti-miR-122-Huh7细胞),接种BALB/c-nu裸鼠建立移植瘤模型,并随机分为模型组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(57.5g/kg)、低剂量组(28.75 g/kg)和5-FU阳性药组(0.025g/kg),观察叶下珠复方Ⅱ号对anti-miR-122-Huh7细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用效果,采用免疫组化法检测瘤体组织细胞核抗原(PCNA)的表达,TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡,采用qRT-PCR法检测移植瘤组织miR-122、C/EBPα、HNF4α及IGF-1R的mRNA表达,Western blot法检测瘤体组织C/EBPα、HNF4α和IGF-1R的蛋白表达.结果 叶下珠复方Ⅱ号对anti-miR-122-Huh7细胞裸鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用,且呈明显的剂量-效应关系;与模型组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组的移植瘤瘤重均显著降低(P＜0.05),且叶下珠复方Ⅱ号高剂量组移植瘤组织细胞PCNA的表达减少,凋亡细胞增多.叶下珠复方Ⅱ号高剂量组裸鼠移植瘤组织miR-122的表达显著增加,C/EBPα及HNF4α的mRNA和蛋白表达均显著上调,IGF-1R的mRNA与蛋白表达显著下调,与模型组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 叶下珠复方Ⅱ号对anti-miR-122-Huh7细胞裸鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用,作用机制与增强转录因子HNF-4α和C/EBPα的表达,从而促进miR-122的表达,抑制其靶基因IGF-1R的表达有关.

肝细胞癌(HCC)是一种发病隐匿、高发病率、高致死率的恶性肿瘤,对人类身心健康构成了重大威胁,但其病理机制仍需进一步研究.手术、放疗、化疗和靶向药等治疗方法给肝细胞癌带来良好作用的同时也带来许多不良反应.然而,中医药在治疗肝细胞癌发挥着独特的优势,目前除了在临床实践中不断丰富中医药治疗肝细胞的理论外,从分子生物学角度分析中医药对肝细胞癌的作用通路、靶点及作用机制的研究发展迅速.笔者通过阅读国内外文献发现,中医药无论是单体还是复方,通过多通路、多途径、多靶点直接或间接阻止了 HCC的发生和进展,与细胞增殖、转移、细胞凋亡、自噬、炎症反应、免疫应答等生理病理过程息息相关.该文对中医药抗肝细胞癌的作用通路与发生机制的国内外文献进行分析、归纳并总结,其中包括异甘草素、铁皮石斛、叶下珠复方Ⅱ号等可以调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路,抑制肿瘤细胞生长、增殖和降低转移率;蟾蜍毒、薯蓣皂荚等通过调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路,诱导和增强HCC自噬;杨梅素、芦笋、鳖甲煎丸等调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,促进HCC细胞周期停滞、抑制血管生成和诱导细胞凋亡;篇蓄、四棱、车前草苷等对核转录因子-κB(NF-κB)信号通路进行调控,抑制炎症反应、抑制HCC转移和降低耐药性;槲皮素、灯盏花等调节Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子及转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路,抑制上皮-间质转化(EMT)事件和重塑细胞骨架等.以上总结旨在为中医药治疗肝细胞癌的深入研究及其临床应用提供理论依据.