本研究的目的在于建立黄扯旗鱼(Pristella maxillaris)的核型分析方法,以了解该物种的染色体数目、形态及分类等遗传学特征.比较头肾-PHA法和胚胎制片法制备黄扯旗鱼染色体样品的异同.结果发现,头肾-PHA法难度较大,操作复杂且制备的分裂相细胞数目较少;而胚胎法操作简单,用时短,制备的分裂相细胞稳定且数目多.随后基于胚胎制片法利用Photoshop CS5和image J软件进行了黄扯旗鱼的核型分析.统计结果表明,黄扯旗鱼核型为2n=52=6m+ 12sm+ 34t,NF=70,且未发现多倍体、异型性染色体及随体染色体的现象.

三倍体湘云鲫2号是通过倍间杂交产生的一种多倍体鱼(红鲫(♀)×异源四倍体鲫鲤(♂)),因其不育性状,具有重要的生产和科研价值.有研究表明线粒体在动物育性的分子调控机制中扮演了重要角色,但在鱼类中尚没有相关的研究报道.利用本实验室特有遗传背景清晰的实验鱼品系(三倍体湘云鲫2号、二倍体红鲫、异源四倍体鲫鲤和同源三倍体鲫),通过荧光定量PCR技术对比分析了它们性腺中线粒体DNA的拷贝数,发现三倍体湘云鲫2号雄性个体精巢中mtDNA含量较正常水平高,雌性个体卵巢中mtDNA含量较正常水平低.实验首次从线粒体DNA含量影响生殖细胞发育的角度探索线粒体与三倍体湘云鲫2号不育的关系,为三倍体湘云鲫2号不育分子机制的研究提供了一些新的基础数据.

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的起源和迁移已在多种鱼类进行了研究,但多倍体鲫鲤原始生殖细胞的标记和迁移尚未见报道.本实验室前期通过远缘杂交方法成功获得了一个倍性明确、亲缘关系清晰的多倍体杂交鱼研究体系,该体系由异源四倍体鲫鲤及其二倍体父母本和三倍体杂交后代组成.本文利用RNA定点表达(localized RNA expression,LRE)技术,将来自于斑马鱼的nanos 1-3’-UTR与GFP融合后生成的mRNA注射入多倍体鱼受精卵中,首次对多倍体鲫鲤原始生殖细胞进行标记,并观察了其迁移途径.结果显示,多倍体鲫鲤PGCs能被斑马鱼GFP-nanos 1-3’-UTR标记,并且多倍体鲫鲤PGCs的迁移与斑马鱼类似.本实验结果为多倍体鲫鲤原始生殖细胞的产生和迁移的研究提供了一些基础数据.

银鲫(Carassius auratus gibelio Bloth)具有将其他鱼类精子的染色体组、染色体片段并入到卵核中协同发育的能力,但通过异精雌核生殖自发形成异源八倍体子代的概率极低.研究采用0.25％、0.5％、1％、2％和4％胰蛋白酶溶液处理白鲫精子10min后以及1％胰蛋白溶液处理白鲫精子5min、10min、15min、20min和25min后,分别与异育银鲫A+系成熟卵子受精;接着通过比较对照组和不同处理组合中精子结构和活力的变化,兼顾受精率、孵化率、成活率等繁育指标与较高的子代八倍体率,建立了一种将外源精子基因组整入雌核生殖银鲫卵子创制异源八倍体的有效方法.即采用1％胰蛋白溶液处理白鲫精子15min后与异育银鲫A+系成熟卵子受精,子代的平均存活率为(2.4±0.7)％,平均八倍体率可达(16.3±0.5)％.批量处理并结合流式细胞术筛选6月龄子代,获得57尾融入有白鲫精子染色体组的异源八倍体成鱼.研究为创制异育银鲫优异异源八倍体种质提供了一个简单易行的方法,创制的异源八倍体可作为后续培育生长快、抗病能力强的银鲫新品种的核心育种材料.

为研究生殖干细胞(Germline stem cells,GSCs)的标记基因nanos2的功能,在银鲫(Carassius gibelio)中克隆了两个nanos2的同源基因(Homologs),将其命名为Cgnanos2a和Cgnanos2b,等位、系统进化树和共线性分析表明,在银鲫进化历程中发生了额外的两轮多倍化事件,是一个异源六倍体.qPCR分析表明Cgnanos2a和Cgnanos2b在5月龄银鲫精巢中的表达水平最高,其次是卵巢;对在孵化后25-190d的卵巢中的表达动态分析表明,孵化后25d的卵巢中的Cgnanos2a和Cgnanos2b转录水平最高,随后表达水平急剧下降;并且Cgnanos2a和Cgnanos2b呈现出偏向表达的特征.切片RNA原位杂交实验结果表明,Cgnanos2a和Cgnanos2b均特异地在银鲫卵巢邻近生殖上皮的胞囊(Cyst)中一类直径小于20 μm的细胞中表达,Cgnanos2a在精巢精小囊边缘一类单个或两个紧紧相邻的细胞中高表达,推测是银鲫的GSCs.此外,还可在精原细胞和初级精母细胞中检测到Cgnanos2a和Cgnanos2b的转录本.研究通过对nanos2阳性细胞的追踪描绘了银鲫卵巢早期胞囊的发育过程,为后续分离银鲫GSCs奠定了基础;同时对银鲫nanos2两个歧化的部分同源基因的序列特征、进化及表达特征分析,为研究鱼类多次多倍化事件后重复基因的进化提供了一个典型例子.

前期研究表明ATP竞争性小分子抑制剂SP600125在体外可以高效诱导鱼类细胞多倍化.研究首次尝试用SP600125直接孵育鲫受精卵以获得多倍体鱼的可能性.结果显示SP600125处理受精卵虽然能够引起部分胚胎倍性发生改变,但也显著影响胚胎发育并导致胚胎高死亡率,同时伴随着畸形鱼苗的发生,其中主要表现为脊椎弯曲和尾缺失等骨骼发育异常.SP600125处理导致骨骼畸形在SP600125孵育鲫鱼苗试验中也同样获得验证.荧光定量PCR检测结果表明,在体(受精卵和鱼苗)或离体(培养的尾鳍细胞)状态下,SP600125孵育会引起smad6、stat1、lef1、bmp2和twist1等骨骼发育相关基因mRNA水平显著上调.相关结果为进一步调整SP600125诱导的鱼类倍性操作策略和方法提供了重要理论参考.

多倍体是指细胞中存在2套以上的染色体组.在自然界中,多倍体现象广泛存在,常见于植物类、鱼类、两栖动物类,但在哺乳动物中少见.正常生理状态下,人体多倍体细胞一般仅见于心脏、骨髓、肝脏等特定组织和器官.其中,已证实肝细胞多倍体与肝脏再生、稳态、终末分化、衰老等相关,但关于其具体功能和作用机制目前尚未明确.