目的:观察大黄灵仙方对肝内胆管细胞炎症模型大鼠MAPK/NF-κB信号通路中IKKα、ASK1、MKK3以及CX3CL1关键因子的表达水平的影响,探讨其缓解肝内胆管细胞炎症的改善作用及可能机制.方法:45只SD大鼠按照完全随机方法分为9组,每组大鼠5只,空白组、模型组、大黄灵仙颗粒组、NF-κB组、p38MAPK组、NF-κB+p38MAPK组、NF-κB+大黄灵仙颗粒组、p38MAPK+大黄灵仙颗粒组、NF-κB+p38MAPK+大黄灵仙颗粒组.除空白组外,余下各组大鼠均在胆总管注射5 mg/kg LPS制备肝内胆管炎症模型.第7天灌胃结束后取大鼠胆管树,采用HE染色观察其炎性程度,蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR检测IKKα、ASK1、MKK3以及CX3CL1蛋白及mRNA表达量.结果:HE病理结果显示,模型组的肝内胆管组织和细胞炎症明显,加入大黄灵仙颗粒和信号阻断剂后肝内胆管炎症状态较前改善,总病理评分差异有统计学意义(P＜0.05).与模型组比较,大黄灵仙颗粒组、p38MAPK组、NF-κB组、NF-κB+p38MAPK组、NF-κB+大黄灵仙颗粒组、p38MAPK+大黄灵仙颗粒组、NF-κB+p38MAPK+大黄灵仙颗粒组的ASK1、CX3CL1蛋白及mRNA表达量下降,MKK3 mRNA表达量上升以及p38MAPK组IKKα和NF-κB+大黄灵仙颗粒组MKK3 蛋白表达量上升(P＜0.05).与大黄灵仙颗粒组比较,p38MAPK组、NF-κB组、NF-κB+p38MAPK组、p38MAPK+大黄灵仙颗粒组、NF-κB+大黄灵仙颗粒组、NF-κB+p38MAPK+大黄灵仙颗粒组的 ASK1、CX3CL1 mRNA表达量下降,p38MAPK+大黄灵仙颗粒组、NF-κB+大黄灵仙颗粒组、NF-κB+p38MAPK+大黄灵仙颗粒组的MKK3 mRNA表达量上升(P＜0.05).与大黄灵仙颗粒组相比,p38MAPK组的IKKα蛋白表达量下降,NF-κB+大黄灵仙颗粒组的ASK1、MKK3蛋白表达量上升(P＜0.05),而NF-κB+p38MAPK+大黄灵仙颗粒组的CX3CL1 蛋白表达量下降(P＞0.05).结论:大黄灵仙方可缓解LPS诱导的大鼠肝内胆管炎症反应,促进胆管细胞的修复,从而达到降低PIS发生及术后复发的目的,其作用机制可能与抑制NF-κB/MAPK信号通路中的IKKα、ASK1、MKK3以及CX3CL1关键炎症因子的活化有关.

目的 观察大黄灵仙方调控白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK)-1和IRAK-4以及成纤维生长因子-3激活酶1MAP3K7结合蛋白2(TGF-3 activator 1 map3k7-binding protein 2,TAB2)的表达水平,探讨其缓解胆管细胞炎症的作用机制,为预防肝胆管结石的形成及术后复发提供理论依据.方法 将45只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为9组,空白组、模型组、大黄灵仙颗粒组、激活核转录因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)阻断剂组、p38丝裂活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)阻断剂组、NF-κB阻断剂+p38MAPK阻断剂组、NF-κB阻断剂+大黄灵仙颗粒组、p38MAPK阻断剂+大黄灵仙颗粒组、NF-κB阻断剂+p38MAPK阻断剂+大黄灵仙颗粒组,每组大鼠5只.除空白组以外,其余各组大鼠于胆总管处一次性注射5 mg/kg内毒素脂多糖以构建肝内胆管感染动物模型.第7天灌胃结束后取材,取大鼠完整胆管树组织,采用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR检测IRAK-1、IRAK-4、TAB2蛋白及mRNA表达量.结果 (1)与空白组比较,模型组IRAK-1、IRAK-4、TAB2蛋白及mRNA表达量升高(P＜0.05);(2)与模型组比较,大黄灵仙颗粒组、NF-κB阻断剂组、p38MAPK阻断剂组、NF-κB阻断剂+p38MAPK阻断剂组、NF-κB阻断剂+大黄灵仙颗粒组、IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白及mRNA表达量降低(P＜0.05),NF-κB阻断剂+p38MAPK阻断剂+大黄灵仙颗粒组IRAK-1、IRAK-4、TAB2蛋白及TAB2 mRNA表达量均显著下降(P＜0.05);(3)与大黄灵仙颗粒组比较,NF-κB阻断剂+大黄灵仙颗粒组、NF-κB阻断剂+p38MAPK阻断剂+大黄灵仙颗粒组IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白表达量和NF-κB阻断剂+p38MAPK阻断剂组的IRAK-1、IRAK-4、TAB2 mRNA表达量均下降(P＜0.05).结论 大黄灵仙方可缓解内毒素脂多糖诱导的大鼠胆管炎症反应,抑制炎症因子的异常表达,促使胆道恢复至非炎症状态,从而达到预防肝胆管结石的形成及术后复发的目的,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号通路下游IRAK-1、IRAK-4和TAB2因子的活化有关.

目的:以LPS构建胆道炎症大鼠模型,结合使用信号通路阻断剂,大黄灵仙方干预治疗,探讨大黄灵仙方调控TLR4/MyD88信号通路缓解胆管细胞炎性反应的作用机制.方法:将50 只清洁级健康SD大鼠随机分为空白组、内毒素脂多糖(LPS)对照组、LPS+中药治疗组、LPS+信号阻断剂(PDTC+SB203580)组、LPS+PDTC+SB203580+中药组,每组大鼠10只.除空白组外,其余各组建立大鼠胆管炎症模型.于造模前3天开始灌胃给药,每天2次,间隔12 h,灌胃液体量为每天2 mL/100 g体质量,一直延续至成模后72 h,大黄灵仙方给药剂量为320 mg/(kg·d).无中药组可给予等量蒸馏水代替.信号通路阻断剂每天注射1次,连续干预3 d,其中PDTC按120 mg/(kg·d)剂量大鼠进行腹腔注射,SB203580按照10 mg/(kg·d)大鼠腹腔注射.截取胆管周围组织,HE染色观察其炎性程度,实时荧光定量PCR和Western Blot检测TLR4/MyD88 信号通路及下游炎症因子相关基因及蛋白表达水平.结果:与空白组比较,LPS对照组、LPS+PTDC+SB203580组的大鼠胆管组织病理形态学提示胆管炎症明显,TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-αmRNA 及蛋白表达,均增加明显,差异均具统计学意义(P <0.05);与LPS对照组比较,LPS+中药组、LPS+PTDC+SB203580+中药组的大鼠胆管组织病理形态学明显改善,其TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-αmRNA及蛋白表达则降低明显,差异均具统计学意义(P<0.05).结论:大黄灵仙方可有效改善胆管细胞病理形态结构,通过下调TLR4/MyD88信号通路的表达水平,阻断下游炎症因子的表达,促使胆道恢复至非炎症状态,从而预防及治疗胆石病.

目的 通过观察大黄灵仙方调控NF-κB信号通路相关因子基因的影响,探讨其对胆管细胞炎性反应.方法 采用大鼠胆总管注射LPS构建原发性胆管结石胆管慢性炎症状态,取大鼠肝内胆管内皮细胞,通过CCK-8检测胆管细胞增殖、qPCR技术同时结合使用信号通路阻断剂,观察胆管细胞炎性状态下NF-κB信号通路相关因子基因影响变化,及大黄灵仙方的干预作用.结果 以LPS浓度差异对于胆管细胞进行炎性致敏,后检测细胞增殖效率,结果发现:观察D组的增值率最高,达95％.与空白组比较,LPS对照组、LPS+ PDTC组、LPS+ SB203580组、LPS+ PTDC+ SB203580组的Myd88、TRAF6、TAK1、IKKa、NF-κBmRNA表达,均增加明显,LPS+中药组、LPS+ PDTC+中药组、LPS+ SB203580+中药组、LPS+ PTDC+SB203580+中药组,则降低明显,差异均具统计学意义(P＜0.05);与LPS对照组比较,LPS+ PDTC组、LPS+ SB203580组、LPS+PTDC+ SB203580组的Myd88、TRAF6、TAK1、IKKa、NF-κBmRNA表达,有所降低,但无明显差异(P＞0.05),LPS+中药组、LPS+ PDTC+中药组、LPS+SB203580+中药组、LPS+PTDC+ SB203580+中药组,则降低明显,差异均具统计学意义(P＜0.05);与LPS+中药组比较,LPS+ PDTC+中药组、LPS+ SB203580+中药组、LPS+PTDC+ SB203580+中药组的Myd88、TRAF6、TAK1、IKKa、NF-κBmRNA表达,有所降低,但无明显差异(P＞0.05).结论 1mg/ml是大黄灵仙方进行胆管细胞炎性实验的较佳浓度,胆管细胞炎性反应过程中存在NF-κB信号通路相关因子表达异常,NF-κB、MAPK信号阻断剂可延缓NF-κB信号通路相关因子表达,大黄灵仙方可调控NF-κB信号通路相关因子基因.

目的 研究大黄灵仙方对胆道炎症大鼠模型p-p38MAPK、p-NF-κB信号通路表达水平的影响,探讨其缓解胆管细胞炎症反应的机制.方法 大鼠胆总管一次注射5mg/kg脂多糖(LPS)构建肝内胆管感染动物模型.按随机数字表法将大鼠分为空白对照组、LPS对照组、LPS+中药组、LPS+ PDTC组、LPS+ SB203580组、LPS+ PDTC+SB203580组、LPS+ PDTC+中药组、LPS+SB203580+中药组、LPS+PDTC+SB203580+中药组.中药组予中药大黄灵仙方(DHLX)灌胃,其余组予蒸馏水灌胃,配合使用p38MAPK阻断剂(SB203580)、NF-κB阻断剂(PDTC),截取胆管周围组织,HE染色观察其炎性程度,Western blot测定胆管组织中p-p38MAPK、p-NF-κB信号通路的蛋白表达水平.结果 各组胆管组织HE染色显示LPS对照组、LPS+PDTC组、LPS+ SB203580组、LPS+ PDTC+SB203580组胆管炎症明显,加入DHLX干预后胆管炎症状态较前改善,总病理评分差异有统计学意义(P＜0.05);Westem blot结果表明胆管炎症大鼠胆管细胞中p-p38MAPK、p-NF-κB蛋白的表达水平,在LPS+PDTC组、LPS+ SB203580组、LPS+ PDTC+ SB203580组显著高于空白组与LPS对照组(P＜0.05);LPS+PDTC+中药组、LPS+ SB203580+中药组、LPS+ PTDC+ SB203580+中药组p-p38MAPK、p-NF-κB水平则显著低于LPS+ PDTC组、LPS+ SB203580组、LPS+ PDTC+SB203580组(P＜0.05);LPS对照组中p-p38MAPK蛋白的表达水平与空白对照组相比无明显变化(P＞0.05),而p-NF-κB蛋白的表达水平在LPS对照组显著高于空白对照组(P＜0.05),LPS+中药组的p-NF-κB表达水平与LPS对照组相比有所降低,但无明显差异(P＞0.05).结论 大黄灵仙方能缓解胆管细胞炎症反应,其作用机制可能与调节p-p38MAPK、p-NF-κB信号通路介导的蛋白失衡有关.

目的 通过观察大黄灵仙方调控TLR4/NF-κB/MAPK信号通路相关因子基因及蛋白的影响,探讨其对胆管细胞炎性反应的作用.方法 采用大鼠胆总管注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建原发性胆管结石胆管慢性炎症状态,取大鼠肝内胆管内皮细胞,通过qPCR技术同时结合使用信号通路阻断剂,观察胆管细胞炎性状态下TLR4/NF-κB/MAPK信号通路相关因子基因及蛋白影响变化及大黄灵仙方的干预作用.结果 ①Myd88、p-p38、TLR4、NF-κB mRNA变化情况:与空白组比较,L组、L+P组、L+S组、L+P+S组的各指标,均增加明显,剩余各组则降低明显,差异均具统计学意义(P＜0.05).与L组比较,L+P组、L+S组、L+P+S组的各指标有所降低,但差异无统计学意义(P＞0.05),L+T组、L+P+T组、L+S+T组、L+P+S+T组则降低明显,差异均具统计学意义(P＜0.05);与L+T组比较,L+P+T组、L+S+T组、L+P+S+T组的各指标有所降低,差异无统计学意义(P＞0.05).②Myd88、p-p38、TLR4、NF-κB蛋白变化情况:变化趋势与mRNA相同.结论 大黄灵仙方可有效逆转胆管细胞炎性反应过程中存在的TLR4/NF-κB/MAPK信号通路相关因子及蛋白表达异常现象,其机制可能与NF-κB、MAPK信号阻断有关.

目的:探讨大黄灵仙方对LPS诱导的肝内胆管组织损伤大鼠Wnt5a-钙离子(Ca2+)-活化蛋白激酶C(PKC)信号转导通路及炎症反应的影响.方法:SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、大黄灵仙方组(320 mg/kg)、炎症信号阻断剂组(PDTC+SB203580,120 mg/kg+10 mg/kg)、大黄灵仙方+信号阻断剂组(320 mg/kg+120 mg/kg+10 mg/kg),每组12只.采用胆总管注射内毒素LPS构建肝内胆管组织损伤模型,分别于造模前和造模后连续给药3 d,2次/d.末次给药12 h后,ELISA检测血清总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)及肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-6水平;截取胆管周围组织,HE染色观察组织病理变化;荧光免疫法检测胆管组织细胞内Ca2+水平;RT-qPCR和Western blot检测胆管组织Wnt5a、骨桥蛋白(OPN)、PKC mRNA及蛋白表达水平.结果:与正常对照组相比,模型组大鼠血清TBIL、TBA、TNF-α、IL-6水平、胆管组织细胞内Ca2+水平、胆管组织Wnt5a、OPN、PKC mRNA及蛋白、IL-6蛋白表达水平均升高(P<0.05).与模型组相比,炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组大鼠TBIL、TBA、TNF-α、IL-6水平、细胞内Ca2+水平、Wnt5a、OPN、PKC mRNA及蛋白、IL-6蛋白表达水平均降低(P<0.05).与炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组相比,大黄灵仙方+信号阻断剂组上述指标进一步降低(P<0.05).结论:大黄灵仙方可能通过抑制Wnt5a-Ca2+-PKC信号通路活化降低肝内胆管组织损伤大鼠炎症反应.

目的:观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对细胞骨架的影响以及大黄灵仙方调节NF-κB/MAPK信号通路对细胞骨架蛋白的作用.方法:采用鬼笔环肽荧光染色剂对各组干预后的胆管上皮细胞进行染色,在激光共聚焦显微镜下观察各组细胞骨架的排列情况;采用免疫印迹法检测骨架蛋白F-actin的表达.结果:LPS干预后,胆管上皮细胞出现细胞核皱缩或破损,骨架丝状断裂或成团;通路阻制剂联合大黄灵仙方干预后细胞骨架部分修复;其余各组细胞骨架均有不同程度的断裂.与正常组相比,LPS组F-actin蛋白表达减少(P<0.05);与LPS组相比,LPS组+中药组、LPS+PDTC+中药组、LPS+SB203580+中药组、LPS+PDTC+SB203580+中药组F-actin蛋白表达明显增加(P<0.05);与中药组相比,LPS+PDTC+中药组、LPS+SB203580+中药组、LPS+PDTC+SB203580+中药组F-actin蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05).结论:大黄灵仙方可恢复炎症状态下胆管上皮细胞骨架的排列顺序,保护其微丝结构,其机制可能与调节NF-κB/MAPK信号通路的传导有关.

目的 观察在大黄灵仙方的调控下干细胞生长因子(scf)、酪氨酸激酶受体(c-kit)的表达水平,探讨其影响胆囊动力学改变的可能机制,为大黄灵仙方预防胆石症的发生及复发提供理论依据.方法 将45只SPF级健康雄性豚鼠随机分为正常组、模型组、中药组,其中正常组予正常饲料喂养,模型组、中药组予高脂致石饲料喂养,喂养8周后分别从各组中随机抽取5只豚鼠,肉眼观察下结石形成超过4只,则判断为模型建立成功.造模成功后中药组予大黄灵仙方灌胃,模型组予等体积生理盐水灌胃,连续灌胃给药8周后取豚鼠胆囊组织,HE染色观察观察胆囊组织的病理学改变,Western blot测定胆囊组织中TNFα的表达水平,免疫组化测定胆囊平滑肌组织中scf、c-kit的蛋白表达水平.符合正态分布的计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD多重比较法.结果 HE染色显示模型组胆囊组织炎症明显,中药组胆囊组织内炎症程度较模型组明显减轻.Western blot结果表明在模型组中,胆囊组织中TNFα的表达水平最高,中药组次之,正常组最低(P值均<0.05);免疫组化结果表明豚鼠胆囊平滑肌组织中scf、c-kit蛋白在正常组、中药组中的表达水平显著高于模型组(P值均<0.05).结论 大黄灵仙方能增强胆囊动力功能,其作用机制可能与上调胆囊Cajal间质细胞中的scf、c-kit信号通路有关.

目的:探讨大黄灵仙方对腹腔镜下胆总管切开取石术疗效的影响.方法:将67例胆总管结石患者随机分为治疗组34例和对照组33例.两组患者均行腹腔镜下胆总管切开取石术,术后除常规治疗外,治疗组加服大黄灵仙方汤剂.观察两组患者T管胆汁引流量、术后禁食与肛门排气时间及并发症发生情况;比较两组患者排石率、总有效率及术后复发率.结果:总有效率治疗组为97.05％(33/34),高于对照组的81.82％(27/33)(P=0.041);术后第4天治疗组患者T管引流量为(374.20±90.80)mL,多于对照组的(326.86±68.40)mL(P=0.019);排石率治疗组为80.00％(8/10),高于对照组的33.33％(3/9)(P=0.04);复发率治疗组为3.13％(1/32),低于对照组的22.22％(6/27)(P=0.024);谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶治疗组分别为(55.20±18.63)U/L、(51.32±15.12)U/L、(23.34±9.73)μmol/L、(103.87±40.84)U/L、(56.82±19.38)U/L,分别低于对照组的(67.89±20.65)U/L(P=0.010)、(60.72±17.8)U/L(P=0.023)、(28.66±10.50)μmol/L(P=0.035)、(129.22±49.23)U/L(P=0.025)、(63.13±21.47)U/L(P=0.211);术后肛门排气时间、禁食时间及住院时间治疗组均短于对照组(P<0.05);并发症发生率两组比较差异无统计学意义(P=0.261).结论:大黄灵仙方具有促进腹腔镜下胆总管切开取石术患者胆汁排泄、减轻胆管炎症水肿、减少胆道感染几率、改善肝细胞代谢、促进胃肠功能恢复、防治结石复发等作用.