目的:探讨抑制组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)对人诱导性多能干细胞(hiPSCs)向定型内胚层(DE)分化的调控作用.方法:利用LSD1抑制剂或shRNA抑制LSD1表达,观察hiPSCs形态变化并检测LSD1活性水平,CCK-8方法检测细胞增殖活性,qPCR检测hiPSCs多能性基因及各胚层标志基因的表达,IP-WB方法检测LSD1调控靶基因的复合体模式,ChIP-qPCR方法检测DE标志基因启动子区域组蛋白H3第4位赖氨酸二甲基化和三甲基化(H3K4me2/me3)及第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)水平.结果:(1)抑制LSD1可显著下调hiPSCs多能性基因OCT4、Y染色体性别决定区域盒2(SOX2)及Nanog同源盒(NANOG)的表达水平(P<0.05);显著上调外胚层标志基因β3-微管蛋白(TUBB3),DE标志基因Y染色体性别决定区域盒17(SOX17)和叉头盒A2(FOXA2),以及中胚层标志基因骨形态发生蛋白2(BMP2)的表达水平(P<0.05);(2)当LSD1活性为正常水平的53.4％时利于DE分化;(3)LSD1在hiPSCs核内与组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及阻遏物元件1沉默转录因子辅阻遏物(CoREST)以复合体的形式调控靶基因;(4)抑制LSD1后,SOX17和FOXA2基因启动子区域LSD1与HDAC1结合水平均显著下降,同时H3K4me2/me3和H3K9ac富集水平显著提高(P<0.01).结论:LSD1通过调控DE分化关键基因启动子区域H3K4me和H3K9ac水平来影响hiPSCs向DE的分化能力.

目的 通过在人胚胎干细胞定向分化为定型内胚层过程中,干扰SNAI1基因的表达,观察其对细胞命运及迁移运动能力的影响.方法 采用激活素A诱导人胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化,实验分为两组:对照组转染阴性对照siRNA,实验组转染siSNAI1.通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹鉴定siSNAI1的干扰效果;通过qRT-PCR和细胞免疫荧光检测定型内胚层标志物的表达情况;通过细胞划痕实验测定细胞的迁移运动能力.结果 由于siSNAI1的干扰作用,细胞内SNAI1的mRNA含量显著降低,SNAI1蛋白的表达受阻;干扰SNAI1的表达会显著抑制定型内胚层标志物FOXA2、GATA4、GATA6以及细胞迁移运动有关基因TGFβ1、KLF8的表达,细胞的迁移能力下降.结论 SNAI1决定内胚层分化效率和细胞迁移能力的获得.

目的:利用Tet-On系统构建稳定表达胰十二指肠同源异形框1(Pdx1)的小鼠胚胎干细胞(ESC)株,为进一步研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化奠定了基础.方法:采用Tet-On系统构建具有绿色荧光蛋白标记及嘌呤霉素抗性的Pdx1过表达慢病毒载体并感染胚胎干细胞.实验分为空白对照组(ESC组)、空载慢病毒对照组(PDX1-ESC组)和Pdx1慢病毒转染组(PDX1+ESC组).流式细胞术检测多西环素(DOX)筛选后转染细胞的阳性率;检测Tet-On系统功能及Pdx1的mRNA和蛋白表达.流式细胞分选仪分选转染细胞,构建稳定表达Pdx1基因的ESC株及阴性对照ESC株.结果:(1)DOX筛选后PDX1-ESC组的转染细胞阳性率为90.72％,PDX1+ESC组的转染细胞阳性率为94.01％.用流式细胞分选仪分选后PDX1-ESC组的转染细胞阳性率为97.84％,PDX1+ESC组为98.13％.(2)加入DOX后,PDX1-ESC组和PDX1+ESC组可见绿色荧光.PDX1+ESC组Pdx1的mRNA和蛋白表达明显增高(P<0.05).不加DOX,则3组细胞均未见绿色荧光,且Pdx1 mRNA和蛋白表达的差异无统计学显著性(P>0.05).(3)细胞株冻存3个月后复苏培养仍然存活,并受DOX调控.结论:利用Tet-On系统成功构建可诱导表达Pdx1的小鼠ESC株,为研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化提供了有效的细胞模型.