目的 初步探究微小隐孢子虫微线体蛋白(MIC)糖蛋白900(GP900)829～1 099aa片段(GP900829～1099)通过核因子-κB(NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)的免疫调节作用.方法 从NCBI数据库中获取微小隐孢子虫GP900829～1099氨基酸序列进行生物信息学分析.以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,PCR扩增gp900829～1099基因片段,构建pET-32a-gp900829～1099重组质粒并转化至BL21感受态细胞中诱导表达.纯化、超滤浓缩重组蛋白并去除内毒素.采用0.16、0.80、4.00、20.00、100.00、500.00 μg/ml的GP900829～1099重组蛋白刺激RAW264.7细胞24 h后,CCK-8法检测其对RAW264.7细胞活力的调节作用.以0.16、0.80、4.00 μg/ml的GP900829～1099重组蛋白刺激RAW264.7细胞,以PBS为对照组,脂多糖(1 μg/ml)为阳性对照,24 h后流式细胞术检测CD86表达量,qPCR检测RAW264.7细胞中IL-6和TNF-α mRNA的相对转录水平,ELISA检测RAW264.7细胞培养上清中IL-6、TNF-α的表达水平.采用蛋白质免疫印迹分析NF-κB和MAPK信号通路中P65蛋白和细胞外调节蛋白激酶(ERK)蛋白磷酸化水平.结果 GP900829～1099蛋白二级结构中β转角占比9.23％,无规则卷曲占比64.58％,且含有较丰富的T、B细胞抗原表位.表达的GP900829～1099重组蛋白的相对分子质量约为49000.CCK-8结果显示,GP900829～1099对细胞没有毒性作用,后续实验采用0.16、0.80和4.00 μg/ml作为作用浓度.流式细胞术结果显示,CD86+的阳性表达率分别为(13.500±0.815)％、(18.670±0.657)％、(20.470±1.271)％,后两者均高于对照组的(14.500±0.872)％(t=3.818、3.872,P＜0.05).qPCR结果显示,0.16、0.80和 4.00 μg/ml组 RAW264.7 细胞的 IL-6 mRNA 相对转录水平分别为 1.409±0.050、2.052±0.098 和 3.284± 0.097,均高于对照组的 1.010±0.096(t=3.700、7.595、16.700,均P＜0.05);TNF-α mRNA相对转录水平分别为1.077±0.034、1.440±0.021 和2.378±0.037,后两者均高于对照组 1.000±0.025(t=13.380、30.850,均P＜0.05).ELISA检测结果显示,RAW264.7细胞培养上清中,0.16、0.80和4.00 μg/ml组IL-6的表达水平分别为(535.400± 17.230)、(572.800±8.286)、(555.600±23.940)mg/L,均高于对照组的(454.400±18.630)mg/L(t=3.193、5.809、3.339,P＜0.05);TNF-α细胞因子的表达水平分别为(351.800±12.270)、(386.400±10.250)、(489.800± 10.540)mg/L,后两者均高于对照组的(324.200±11.070)mg/L(t=4.125、10.830,P＜0.05).蛋白质免疫印迹结果显示,0.16、0.80和4.00 μg/ml组RAW264.7细胞p-P65、p-ERK蛋白的相对表达水平分别为2.294±0.254、1.714± 0.205、1.877±0.309,1.522±0.054、1.760±0.066、1.582±0.027,均高于对照组的 1.0±0.0(t=5.100、3.489、2.836,9.737、11.450、21.900,均P＜0.05).结论 不同浓度GP900829-～1099重组蛋白刺激巨噬细胞后,通过激活NF-κB和MAPK信号通路诱导巨噬细胞活化,通过促进TNF-α和IL-6 mRNA的转录参与巨噬细胞的免疫调节.