目的 寄生虫感染与癌症的关系已成为研究热点之一.目前胃肠癌患者肠道单一原虫感染已有报道,但共感染报道较少见.本研究旨在明确胃肠癌患者肠道原虫共感染情况.方法 根据人五毛滴虫、十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、人芽囊原虫、脆弱双核阿米巴和毕氏肠微孢子虫特异的基因序列设计引物进行巢氏PCR扩增,检测195例临床胃肠癌患者肠道原虫共感染情况.结果 巢氏PCR检测结果显示胃肠癌患者肠道原虫总感染率为48.72％(95/195).其中2种原虫共感染23例(8例:人五毛滴虫+人芽囊原虫;11例:人五毛滴虫+微小隐孢子虫;3例:人五毛滴虫+十二指肠贾第虫;1例:十二指肠贾第虫+微小隐孢子虫),占肠道原虫感染的24.21％.3种原虫共感染为3例(1例:人五毛滴虫+微小隐孢子虫+人芽囊原虫;2例:人五毛滴虫+十二指肠贾第虫+微小隐孢子虫),占原虫感染的3.16％.1种原虫感染67例(56例:人五毛滴虫;9例:微小隐孢子虫;1例:人芽囊原虫;1例:脆弱双核阿米巴),占原虫感染的70.52％,未检测到毕氏肠微孢子虫感染.结论 胃肠癌患者存在肠道原虫共感染且感染率较高.单因素方差分析发现人五毛滴虫单独感染病例显著高于含人五毛滴虫的2种原虫共感染(P=0.0022)以及3种原虫共感染病例(P=0.0019),而2种和3种原虫共感染病例的感染率间无明显差异(P=0.2775),表明胃肠道癌症患者中人五毛滴虫单独感染病例高于2种或以上原虫共感染病例.BLAST和单核苷酸多态性分析发现,不同感染原虫的基因序列除个别与GenBank参考序列同源性为100％外,其他基因序列在不同位点出现不同程度的碱基突变、插入或丢失现象.该研究结果为今后胃肠癌患者病因学以及诊断和防治提供了重要参考.

目的 初步探究微小隐孢子虫微线体蛋白(MIC)糖蛋白900(GP900)829～1 099aa片段(GP900829～1099)通过核因子-κB(NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)的免疫调节作用.方法 从NCBI数据库中获取微小隐孢子虫GP900829～1099氨基酸序列进行生物信息学分析.以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,PCR扩增gp900829～1099基因片段,构建pET-32a-gp900829～1099重组质粒并转化至BL21感受态细胞中诱导表达.纯化、超滤浓缩重组蛋白并去除内毒素.采用0.16、0.80、4.00、20.00、100.00、500.00 μg/ml的GP900829～1099重组蛋白刺激RAW264.7细胞24 h后,CCK-8法检测其对RAW264.7细胞活力的调节作用.以0.16、0.80、4.00 μg/ml的GP900829～1099重组蛋白刺激RAW264.7细胞,以PBS为对照组,脂多糖(1 μg/ml)为阳性对照,24 h后流式细胞术检测CD86表达量,qPCR检测RAW264.7细胞中IL-6和TNF-α mRNA的相对转录水平,ELISA检测RAW264.7细胞培养上清中IL-6、TNF-α的表达水平.采用蛋白质免疫印迹分析NF-κB和MAPK信号通路中P65蛋白和细胞外调节蛋白激酶(ERK)蛋白磷酸化水平.结果 GP900829～1099蛋白二级结构中β转角占比9.23％,无规则卷曲占比64.58％,且含有较丰富的T、B细胞抗原表位.表达的GP900829～1099重组蛋白的相对分子质量约为49000.CCK-8结果显示,GP900829～1099对细胞没有毒性作用,后续实验采用0.16、0.80和4.00 μg/ml作为作用浓度.流式细胞术结果显示,CD86+的阳性表达率分别为(13.500±0.815)％、(18.670±0.657)％、(20.470±1.271)％,后两者均高于对照组的(14.500±0.872)％(t=3.818、3.872,P＜0.05).qPCR结果显示,0.16、0.80和 4.00 μg/ml组 RAW264.7 细胞的 IL-6 mRNA 相对转录水平分别为 1.409±0.050、2.052±0.098 和 3.284± 0.097,均高于对照组的 1.010±0.096(t=3.700、7.595、16.700,均P＜0.05);TNF-α mRNA相对转录水平分别为1.077±0.034、1.440±0.021 和2.378±0.037,后两者均高于对照组 1.000±0.025(t=13.380、30.850,均P＜0.05).ELISA检测结果显示,RAW264.7细胞培养上清中,0.16、0.80和4.00 μg/ml组IL-6的表达水平分别为(535.400± 17.230)、(572.800±8.286)、(555.600±23.940)mg/L,均高于对照组的(454.400±18.630)mg/L(t=3.193、5.809、3.339,P＜0.05);TNF-α细胞因子的表达水平分别为(351.800±12.270)、(386.400±10.250)、(489.800± 10.540)mg/L,后两者均高于对照组的(324.200±11.070)mg/L(t=4.125、10.830,P＜0.05).蛋白质免疫印迹结果显示,0.16、0.80和4.00 μg/ml组RAW264.7细胞p-P65、p-ERK蛋白的相对表达水平分别为2.294±0.254、1.714± 0.205、1.877±0.309,1.522±0.054、1.760±0.066、1.582±0.027,均高于对照组的 1.0±0.0(t=5.100、3.489、2.836,9.737、11.450、21.900,均P＜0.05).结论 不同浓度GP900829-～1099重组蛋白刺激巨噬细胞后,通过激活NF-κB和MAPK信号通路诱导巨噬细胞活化,通过促进TNF-α和IL-6 mRNA的转录参与巨噬细胞的免疫调节.

本研究以微小隐孢子虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Cryptosporidium parvum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,CpGAPDH)为对象,研究其亚细胞定位和酶动力学特征.设计特异性抗原多肽并免疫家兔,获得多克隆抗体,利用亲和纯化法获特异性抗体;经Western blot方法验证该抗体特异性,再通过间接免疫荧光法(IFA)进行蛋白定位.通过原核表达获得GST重组蛋白(GST-CpGAPDH),基于GAPDH的酶促反应利用辅酶NAD(H)或NADP(H)为电子受体或供体的原理,通过吸光度比色法监测反应中NAD(H)/NADP(H)的增加或减少鉴定其酶活性.结果显示,成功获得并纯化抗 CpGAPDH 抗体;Western blot分析显示该抗体可识别条带大小为 40 kDa;IFA结果表明该蛋白主要分布于子孢子胞浆内,部分呈现颗粒状.利用重组蛋白确定了CpGAPDH的酶活性;在两种辅酶中,CpGAPDH更倾向于使用NAD(H)进行酶活反应.结果表明,本研究确定了CpGAPDH在虫体细胞的定位及酶活性检测,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.

目的 研究利用流式细胞仪对蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)孢囊和微小隐孢子虫(Crypto sporidium parvum)卵囊的高浓度混合样本进行计数,为“两虫”标准品制备提供技术支撑,以期能降低“两虫”检测试剂成本.方法 利用已知浓度的荧光微球对经免疫荧光染色的“两虫”混合样本进行计数,采用非参数检验中两个相关样本检验方法对流式细胞仪和荧光显微镜计数结果进行统计学分析比较.结果 流式细胞仪方法计数蓝氏贾第鞭毛虫孢囊和微小隐孢子虫卵囊的相对标准偏差(RSD)分别为14.7％和15.2％,比荧光显微镜计数结果的RSD(14.1％和15.1％)稍高.利用Wilcoxon检验得出两种方法对孢囊和卵囊的计数结果差异均无统计学意义(Z=-0.91 8,P=0.359和Z=-0.102,P=0.919).结论 利用流式细胞仪计数高浓度“两虫”混合样本的方法能达到生物学实验要求的精确度,并与荧光显微镜计数方法具有等效性,可弥补荧光显微镜无法直接计数高浓度样本的不足,并为“两虫”标准品的筛选与分装奠定基础.

目的 建立检测隐孢子虫的夹心 ELISA方法.方法 本试验以纯化的抗隐孢子虫 IgG、IgY分别作为包被抗体和捕获抗体,棋盘滴定法确定夹心 ELISA的最适工作条件.用基于18SrRNA的PCR方法评估饱和蔗糖溶液、饱和食盐水漂浮和PBST洗涤剂洗涤3种方法预处理样品对夹心 ELISA检测效果的影响.结果 建立的夹心 ELISA 捕获抗体、抗原、检测抗体、酶标二抗最佳工作浓度分别是1:800、2.5 μg/mL、1:100和1:5000,最适捕获抗体包被、抗原抗体反应、酶标二抗反应条件分别为37 ℃作用1 h后4 ℃过夜、37 ℃作用30 min、45 min;最适终止条件是2 mol/L H2SO4,50 μL/孔;TMB室温显色10 min;特异性试验结果显示仅可以检出隐孢子虫抗原,而与常见肠道寄生的球虫卵囊、圆线虫和蛔虫虫卵无交叉反应.批间和批内变异系数均小于10%.3种方法前处理粪便用于 ELISA检测与 nested-PCR检测结果总符合率分别为95.83%、91.67%和83.33%,以饱和蔗糖溶液漂浮法处理检测样品的效果最佳.与爱德士的隐孢子虫检测试剂盒比较,结果显示,本方法敏感性低于爱德士试剂盒的最低检出量(6×103个/mL),整个试验过程比试剂盒多用15 min,但特异性和重复性均一致,且本试验方法更加经济实用.结论 该方法简便,快速,灵敏,可用于临床粪样中隐孢子虫病原检测或隐孢子虫流行病学调查研究.

目的 扩增微小隐孢子虫卵囊并筛选其纯化方法,以期获得大量有活性的纯净微小隐孢子虫卵囊. 方法 将微小隐孢子虫分离株人工感染犊牛,分别采用饱和蔗糖溶液漂浮法、饱和盐水漂浮法、饱和硫酸锌漂浮法浓集粪便中的卵囊,经氯化铯密度离心纯化后,用脱囊率进行纯化卵囊的活力检测. 结果 3种卵囊浓集方法中,饱和食盐水漂浮法所获得的卵囊杂质少,显微镜下视野干净,经氯化铯密度离心后获得清晰的卵囊带卵囊量为3.5×108个,其中76％的卵囊保持良好活力. 结论 饱和盐水漂浮再结合氯化铯密度离心获得微小隐孢子虫卵囊纯度高、活性良好,可作为实验室批量分离纯化微小隐孢子虫卵囊的首选方案.

目的 探讨Toll样受体在微小隐孢子虫感染致小鼠肠黏膜损伤中的作用机制.方法 30只雄性BALB/c小鼠随机分为正常对照组、感染1周组和感染2周组.用免疫抑制及卵囊灌胃的方法建立微小隐孢子虫肠道感染小鼠模型,感染1周组和2周组分别于感染后7 d和14 d剖杀,正常对照组于感染后14 d剖杀.光镜观察小鼠肠黏膜病理变化,并测量肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛高度/隐窝深度比值;透射电镜观察小鼠肠黏膜超微结构;实时荧光定量PCR(qPCR)、Western blotting技术检测肠黏膜TLR2和TLR4表达情况.结果 光镜下,感染组小鼠肠绒毛水肿,明显萎缩变短,黏膜下层结构水肿,与肌层间形成间隙.与正常对照组比较,感染1周组和感染2周组小鼠空肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度比值均明显降低(P均<0.05),隐窝深度明显升高(P均<0.01);且感染2周组小鼠空肠的绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度比值均明显低于感染1周组(P均<0.05),隐窝深度明显高于感染1周组(P<0.01).透射电镜显示,感染组小鼠的空肠可见微小隐孢子虫卵囊,结构完整,卵囊周围的肠绒毛严重脱落,呈火山口状,卵囊壁与上皮细胞膜融合.qPCR结果显示,与正常对照组相比,感染1周组和感染2周组小鼠肠黏膜TLR2和TLR4 mRNA表达水平明显增高(P均<0.05);且感染2周组小鼠较感染1周组小鼠TLR2和TLR4 mRNA表达水平明显增高(P均<0.05).Western blotting检测结果表明,感染组小鼠肠黏膜TLR2和TLR4蛋白表达量较正常对照组显著增高(P均<0.05),且感染2周组小鼠TLR2和TLR4蛋白较感染1周组小鼠的表达量明显增高(P均<0.05).结论 TLR2和TLR4参与了肠黏膜对微小隐孢子虫的识别,感染导致的肠黏膜损伤可能与其上调TLR2和TLR4表达相关.

目的 探讨微小隐孢子虫糖蛋白GP900对HCT-8细胞Akt和MAPK信号通路的影响,为进一步研究微小隐孢子虫与宿主细胞的相互作用提供理论依据. 方法 以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,PCR扩增GP900基因片段,同收后连接到pMD-18T载体,构建重组克隆质粒pMD-18T-GP900.双酶切pMD-18T-GP900和pET-32a载体并进行连接,构建pET 32a-GP900重组质粒,双酶切及测序鉴定正确后转化人大肠埃希菌BL21(DE3),重组菌用IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析GP900的表达.采用Ni-NTA亲和层析富集和超滤纯化GP900重组蛋白用Triton-114去除内毒素,直至重组蛋白内毒素含量在0.01～0.1 Eu/mg为止,然后用Hydrophobic beads吸附残留的Triton 114,收集重组蛋白.用GP900重组蛋白刺激HCT 8细胞,收集不同刺激时间的细胞,提取全蛋白,采用Western blot检测Akt、p38和ERK的磷酸化;用不同浓度GP900刺激后检测细胞中上述通路蛋白的磷酸化与GP900剂量的关系. 结果 pET-32a-GP900重组质粒经双酶切及测序鉴定构建正确,表达的重组GP900蛋白分子质量与理论值相符.纯化的重组蛋白刺激HCT-8细胞后,Akt在60 min发生磷酸化且随着GP900浓度增加磷酸化程度呈剂量依赖,p38在60 min发生磷酸化但不呈剂量依赖,ERK在90 min发生磷酸化但不呈剂量依赖. 结论 成功构建了GP900重组质粒,表达的GP900重组蛋白可诱导HCT-8细胞Akt、p38和ERK信号通路活化.

MicroRNAs(miRNAs)作为基因表达关键的转录后调节因子,参与调节上皮细胞防御微小隐孢子虫(Cryptospo-ridium parvum)感染的固有免疫应答.目前,已发现Let-7i,miR-98,miR-27b,miR-513,miR-221,miR-424和miR-503与防御C.parvum感染的固有性免疫调控机制有关,包括调控上皮细胞防御C.parvum感染的反应、启动被感染上皮细胞释放外质体,调控胆管上皮细胞炎性反应,调控TLR/NF-κB信号通路、抑制信号转导转录激活酶蛋白的磷酸化,调控上皮细胞与T细胞的相互作用,以及调控iNOS和IL8 mRNA的稳定性等.本文综述了与C.parvum感染有关的miRNAs在调节宿主细胞固有性免疫反应方面的作用机制.

微小隐孢子虫是近年来导致人和动物水样腹泻的重要寄生原虫之一, 并且至今尚无有效的防控药物和疫苗, 严重威胁着公共卫生安全和畜牧业的健康发展.建立微小隐孢子虫感染动物模型对研究其致病机理、免疫机制、药物防控等均有重要意义.本文综述了近年来报道的国内外感染动物模型及其应用, 以期为防控人畜共患隐孢子虫病提供重要参考.