目的·研究恒河猴(Rhesus)、狨猴(Marmoset)、倭狐猴(Mouse Lemur)这3种代表性灵长类动物的癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)家族成员之一的肉瘤抗原l(sarcoma antigen 1,SAGE1)的进化,及其与整合体复合物(integrator complex,INT)亚基INTS3之间的相互作用的保守性.方法·首先在HEK293T细胞中利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)的方法验证3种灵长类动物的SAGE1和INTS3相互作用.随后在互作蛋白截短的片段上分别添加His-SUM O和GST标签,并在大肠埃希菌中进行表达,经过系列纯化步骤得到目标蛋白.通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)实验测定目标蛋白之间的结合强弱,借助广角激光散射凝胶排阻层析(size exclusion chromatography with multi-angle light scattering,SEC-MALS)技术检测复合物的结合比例,并利用分子对接技术预测SAGE1和INTS3截短体的结合模型.分析人类INTS3和SAGE1互作界面,挑选在灵长类中也相对保守的关键互作氨基酸位点,将其突变后再次使用Co-IP分析INTS3和SAGE1的结合情况.结果·通过Co-IP方法,确定3种灵长类动物中INTS3和SAGE1全长蛋白之间存在相互作用.截短体蛋白经过外源诱导表达和多步纯化,获得高纯度蛋白样品;经过SPR对其进行结合和解离检测分析,得到了它们的解离常数在微摩尔级别;并且SEC-MALS结果显示INTS3与SAGE1的结合比例为2∶1.使用分子对接预测SAGE1和INTS3截短体结合模型,发现该复合物具有典型的"蝴蝶型结构",由INTS3二聚体组成"蝴蝶身体",由SAGE1组成"蝴蝶头部",结合界面中疏水相互作用构成了主要的互作模式.分析突变后的SAGE1与INTS3全长蛋白相互作用,它们之间的结合明显减弱.结论·恒河猴、狨猴、倭狐猴中INTS3与SAGE1存在相互作用,并且相互作用具有高度的保守性.

整合因子复合物(integrator complex,INT)的发现极大地拓展了对小核RNA转录成熟和基因转录调控的认知,也重新掀起了相关领域的研究热潮.INT是1个至少由14个亚基组成、分子量超过1.4 MD的蛋白质复合物.它一方面通过内切酶活性切割转录本,执行功能;另一方面与PP2A磷酸酶结合,调节RNA聚合酶Ⅱ上C-端重复序列关键位点的去磷酸化,调控RNA聚合酶的转录活性,在多种RNA(信使RNA、小核RNA、增强子RNA等)的转录生成中均发挥重要作用.在小核RNA转录成熟的过程中,INT于转录起始被招募至聚合酶Ⅱ的CTD区,并随之在小核RNA基因上移动;识别3'成熟序列元件后,活性亚基切割转录本,完成短链RNA的转录成熟.同时,它还参与多个生物学过程,例如蛋白质编码基因的转录暂停-释放、转录延伸、增强子转录本生成、DNA和RNA代谢等.在生理病理功能方面,整合因子复合物及其组分在肿瘤发生与个体发育中的重要性也日益凸显.尽管如此,直到最近关于该复合物的组分与结构研究才有了新的突破.组成该复合物的14个亚基以大量的α螺旋为特点,在形成功能模块的基础上进一步组装成庞大的转录调控机器.本文将就整合因子复合物的组成、结构特点、功能研究、疾病关联与问题展望等方面展开论述.

内质网膜蛋白复合物(endoplasmic reticulum membrane complex,EMC)在跨膜蛋白质的生物发生和膜整合中发挥重要作用.内质网膜复合亚基3 (endoplasmic reticulum membrane complex 3,EMC3)是EMC的重要组成部分,但其在生殖细胞中发挥的作用未见报道.本研究通过实时荧光定量PCR法检测18周龄小鼠睾丸、肺、脾、下丘脑组织中的EMC3 mRNA表达水平差异.结果 显示,小鼠睾丸中EMC3 mRNA表达水平较高.体外培养人畸胎癌细胞NCCIT,通过不同浓度衣霉素诱导细胞产生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),应用实时荧光定量PCR法、蛋白质印迹法检测其中EMC3、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatory protein,GRP78)、CCAAT-增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)的mRNA及其蛋白质表达水平.结果 显示,相对于对照组,EMC3、GRP78、CHOP的mRNA与蛋白质水平表达极显著升高(P＜0.01),表明衣霉素成功诱导了NCCIT细胞产生内质网应激,EMC3在衣霉素诱导的内质网应激的精原细胞中,mRNA与蛋白质水平表达升高.以NCCIT细胞cDNA为模板,利用PCR法扩增EMC3基因片段,并将其与pRK5-myc载体连接,构建pRK5-myc-EMC3重组质粒,经双酶切鉴定及DNA测序表明:pRK5-myc-EMC3重组质粒构建成功.将重组质粒和空载体分别转染至NCCIT细胞中进行表达,应用实时荧光定量PCR法与CCK8法检测细胞中GRP78、CHOP的mRNA转录水平以及细胞活力.结果 显示,EMC3转染组的GRP78、CHOP的mRNA水平表达显著升高(P＜0.05),细胞活性极显著降低(P＜0.01),表明EMC3可以在NCCIT细胞中调控内质网应激并抑制细胞存活的发生.综上表明,过表达EMC3能够在精原细胞中调控内质网应激抑制细胞存活,EMC3可能在精原细胞的内质网应激中发挥重要作用.

目的 探讨宫颈癌外周血单核细胞Toll样受体4(TLR4)、核因子 κB(NF-κB)表达变化与肿瘤增殖基因、侵袭基因的相关性.方法 选取2017年9月至2020年9月中南大学湘雅二医院及深圳市龙华区妇幼保健院收治的160例宫颈癌患者作为研究对象.按照病理检查结果及国际妇产科联盟(FIGO)2009年分期标准分为早期宫颈癌组(Ⅰb期/Ⅱa期,n=70)和晚期宫颈癌组(Ⅱb/Ⅲ/Ⅳa期,n=90).另选择同期中南大学湘雅二医院及深圳市龙华区妇幼保健院收治的50例进行宫颈检查的宫颈息肉患者作为对照组.于入院后当日,检测早期宫颈癌组及晚期宫颈癌组肿瘤组织及癌旁正常组织中增殖基因、侵袭基因mRNA表达量,并测定早期宫颈癌组及晚期宫颈癌组外周血单核细胞中TLR4、NF-κB mRNA表达;采用Spearman相关性分析明确外周血单核细胞中TLR4、NF-κB mRNA表达与宫颈癌肿瘤恶性生物学行为的相关性.结果 早期宫颈癌组及晚期宫颈癌组血清NF-κB、TLR4 mRNA水平显著高于对照组,晚期宫颈癌组NF-κB、TLR4 mRNA水平显著高于早期宫颈癌组,差异具有统计学意义(P<0.05);早期宫颈癌组及晚期宫颈癌组肿瘤组织侵袭基因p21-活化的激酶6(PAK6)、高尔基体磷蛋白3(GOLPH3)、zeste 2多梳抑制复合物2亚基增强子(EZH2)mRNA表达量显著高于癌旁正常组织,桥接整合因子1(Bin1)mRNA表达量显著低于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05).晚期宫颈癌组PAK6、GOLPH3、EZH2 mRNA表达量显著高于早期宫颈癌组,差异具有统计学意义(P<0.05);晚期宫颈癌组Bin1 mRNA表达量显著低于早期宫颈癌组,差异具有统计学意义(P<0.05);早期宫颈癌组及晚期宫颈癌组肿瘤组织增殖基因叉状头/翅膀状螺旋转录因子(FOXP3)、INK4、血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)、同源盒基因B7(HOXB7)mRNA表达量显著高于癌旁正常组织,LRRC3B mRNA表达量显著低于癌旁正常组织(P<0.05).晚期宫颈癌组FOXP3、INK4、PAX6、HOXB7 mRNA表达量显著高于早期宫颈癌组,差异具有统计学意义(P<0.05);经Spearman相关性分析发现:外周血单核细胞NF-κB、TLR4 mRNA表达与宫颈癌患者肿瘤组织增殖基因FOXP3、INK4、AN-GPTL4、HOXB7 mRNA水平呈正相关(P<0.05);与肿瘤组织侵袭基因PAK6、GOLPH3、EZH2 mRNA表达量呈正相关,与Bin1 mRNA表达量呈负相关(P<0.05).结论 外周血单核细胞中TLR4、NF-κB表达越高,宫颈癌分期及肿瘤恶性程度越高,可能作为肿瘤病情判断的简便手段,值得深入研究.

层黏连蛋白332(Laminin-332,Ln-332)是基底膜的主要成分之一,它是真表皮连接处锚定复合物中的关键分子,在维持基底膜完整性中发挥重要作用.该蛋白作为配体可与细胞跨膜蛋白整合素α6β4、α3β1等相互作用,参与细胞的黏附、迁移.在正常皮肤中,Ln-332通过与整合素α6β4及Ⅶ型胶原连接,将半桥粒附着于真皮.当基底膜遭到破坏时,Ln-332分泌快速增加,与整合素α3β1结合,作为细胞迁移的支架,促进角质形成细胞向创面迁移,从而加速伤口愈合.编码Ln-332的相关基因突变可导致交界性大疱性表皮松解症;而对Ln-332不同亚基的自身抗体可引起抗Ln-332型黏膜类天疱疮.此外,研究发现Ln-332可促进某些上皮来源肿瘤的侵袭、转移,参与形成肿瘤微环境.