目的 研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间的相互作用. 方法 以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增EtAMA1和EtMIC2基因,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-EtAMA1及捕获载体pGADT7-EtMIC2并转化Y2HGold酵母菌中,观察酵母在营养缺陷选择培养基上的生长情况.原核表达 GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白,纯化后进行GST-Pulldown试验.同时构建真核表达载体pcDNA3.1-His- EtAMA1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2并转染HEK-293T细胞,收集细胞裂解液,进行免疫共沉淀试验.在此基础上构建双分子荧光互补载体pEtAMA1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151并转染HEK-293T细胞,激光共聚焦观察转染细胞荧光发生情况. 结果 诱饵基因和捕获基因均对酵母双杂交系统无自激活和毒性作用,pGBKT7-EtAMA1/ pGADT7-EtMIC2共转化菌能激活酵母双杂交报告系统;原核表达并纯化GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白进行 GST-Pulldown试验,二者可在体外相互作用;EtAMA1和EtMIC2可在HEK-293T细胞中共表达,免疫共沉淀试验进一步证实二者间的相互作用;双分子荧光互补技术验证EtAMA1和EtMIC2在细胞内存在相互作用. 结论 通过酵母双杂交、GST-Pulldown、免疫共沉淀及双分子荧光互补技术验证柔嫩艾美耳球虫顶膜抗-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(Et- MIC2)之间存在相互作用,这为揭示微线蛋白在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的分子机制提供了理论基础.

鸡球虫病在我国广泛流行,严重影响我国养鸡业健康发展.目前各地关于鸡球虫流行情况均有报道,但鲜见关于全国整体流行情况的报道分析.本文对建国后各地的调查报告进行了梳理,发现我国各地鸡群球虫感染率均在50％以上,常见的虫种有柔嫩、 巨型、 堆型、 和缓和毒害艾美耳球虫等,影响我国鸡球虫病流行的因素有饲养管理方式、 环境及气候、 免疫抑制或其他疾病、 鸡只日龄等.同时我们还发现文献中检测鸡球虫的手段还比较落后,仅采用镜检球虫卵囊的占60％以上,并且调查范围局限于一市的占80％以上.由此可见,我国鸡球虫病流行严重,影响因素较多,而且流行病学调查手段落后、 范围小,我们应当采用综合防控措施,并提高检测手段,以期控制鸡球虫病流行,促进养鸡业健康发展.

为了探究京海黄鸡感染柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)后盲肠组织差异表达基因,以及球虫感染分子应答过程和免疫应答机制,试验采用RNA-seq技术对E.tenella感染和非感染组第7天的盲肠组织进行转录组测序,筛选差异表达基因,并进行差异基因的功能、通路富集分析.结果表明,在感染和非感染组中有显著差异的表达基因2830个(P<0.05),其中1419个基因上调,1411个基因下调.随机选取10个差异基因进行qRT-PCR验证,结果显示差异基因的表达倍数与RNA-seq检测结果显著相关(r=0.988,P<0.000),决定系数达0.975.GO分析表明,有2356个差异基因获得GO功能注释,显著富集的前30个GO terms主要涉及细胞交流、信号转导、血管生成、氧化还原酶活性等.KEGG分析发现差异基因显著富集的信号通路有黏着斑、细胞外基质-受体相互作用、过氧化物酶体增殖物激活受体等.这些通路中的差异基因有ANGPTL4、ACSL5、VEGFC、CD44和MAKP10等,提示这些基因在宿主柔嫩艾美耳球虫感染过程中发挥重要作用.

本研究将‘软籽石榴’作为实验材料,将感染柔嫩艾美耳球虫的3周龄Cobb肉仔鸡作为研究对象,考察石榴果皮水提物组、氨丙啉组、未用药组和对照组的每克粪便中的卵囊数、体重增量和饲料转化率之间的差异.结果 显示,治疗7d后,水提物组的每克粪便中的卵囊数和饲料转化率显著低于未用药组,而体重增量显著高于未用药组.不同剂量(1 00 mg/kg,200 mg/kg,400 mg/kg体重)的石榴果皮水提物的抗球虫效果呈剂量依赖性增加,而以400 mg/kg体重的石榴果皮水提物对Cobb肉仔鸡灌胃效果最佳,治疗7d后,每克粪便中的卵囊数(103个)和饲料转化率(1.47)分别达到最低,体重增量达到最高(1 699.99 mg·kg-1·bw-1).因此,石榴果皮水提取物具有较好的抗球虫活性.

目的 观察活性云母组合物液对柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)感染雏鸡的防治效果.方法 7日龄雏鸡200只,随机分为10组(每组20只),分别为A组(空白对照组,不感染球虫,不用活性云母组合物液组)、B组(阳性对照组,即感染球虫,不用活性云母组合物液组)、C组(地克珠利预防组)、D组(6％活性云母组合物液预防组)、E组(4％活性云母组合物液预防组)、F组(2％活性云母组合物液预防组)、G组(地克珠利治疗组)、H(6％活性云母组合物液治疗组)、I组(4％活性云母组合物液治疗组)、J组(2％活性云母组合物液治疗组).C、D、E、F组分别于8日龄起通过饮水给予地克珠利和不同浓度的活性云母组合物液,连续7d.14日龄时除空白对照组外其余各组分别经口感染柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/只.感染球虫卵囊后,C、D、E、F组饮用水换成不含地克珠利和活性云母组合物液的水;G、H、I、J组分别通过饮水给予地克珠利和不同浓度活性云母组合物液,保证饮水充足,连续7d.所有雏鸡自由采食和饮水.攻虫后第8d剖杀,通过平均增重、相对增重率、盲肠病变、卵囊排出情况计算抗球虫指数(Anticoccidial index,ACI) 结果D组的平均增重与对照组B组的平均增重进行两两相比差异有统计学意义(t=-46.0341,P＜0.05),相对增重率为76.73％;E组的平均增重与对照组B组的平均增重进行两两相比差异有统计学意义(t=-77.9200,P＜0.05),相对增重率为72.97％;C组和G组的平均增重均显著高于对照组B组的平均增重(t1=-147.9948,t2=-40.2998,P＜0.05),相对增重率分别为86.48％和83.99％.D组卵囊减少率为93.4％,E组为91.3％,高于I组和J组.综合抗球虫指数显示D组和E组预防柔嫩艾美尔球虫感染效果较好,其抗球虫指数ACI分别为171.7和166.0;其次为H组和I组抗柔嫩艾美尔球虫感染效果较好,其抗球虫指数ACI分别为163.6和161.7;其余两组ACI值均小于160,抗球虫效果一般.结论 6％活性云母组合物液对鸡E.tenella感染具有较好的预防效果,而治疗效果一般.

目的 观察柔嫩艾美耳球虫基因微线蛋白1(EtMIC1)和微线蛋白2(EtMIC2)之间的相互作用,为研究微线蛋白之间相互影响的分子机制以及该互作在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的作用提供参考依据.方法 采用PCR方法克隆柔嫩艾美耳球虫EtMIC1和EtMIC2基因,构建不同的重组表达载体.将构建的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-Et-MIC1及捕获质粒pGADT7-EtMIC2转化至Y2HGold酵母感受态,涂布于对应的营养缺陷培养基进行毒性和自激活活性检测.表达GST-EtMIC1和His-EtMIC2两种融合蛋白,纯化后通过GST-Pull down验证二者在体外的相互作用.将构建的pcDNA3.1-His-EtMIC1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2重组质粒转染HEK-293T细胞,RIPA裂解后取上清进行免疫共沉淀试验,鉴定二者在体内的相互作用.将真核表达载体pEtMIC1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151共转染HEK-293T细胞,激光共聚焦显微镜观察转染后的细胞内发出的红色荧光.结果 pGBKT7-EtMIC1和pGADT7-Et-MIC2单转化对酵母细胞无明显毒性作用,且自身无自激活活性,而pGBKT7-EtMIC1/pGADT7-EtMIC2共转化后能够在显色板上长出蓝色菌落,说明二者在细胞内可相互作用;GST-Pull down试验表明二者可在体外发生相互作用;免疫共沉淀和双分子荧光互补试验证实EtMIC1和EtMIC2在细胞内相互作用.结论 EtMIC1和EtMIC2在体内、外均能够产生相互作用,为进一步探索微线蛋白之间相互影响的分子机制以及该互作在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的作用提供参考依据.