[目的]类黄酮 3'-羟化酶(flavanone 3'-hydroxylase,F3'H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3'H基因的功能及表达特性.[方法]以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎、叶为实验材料,从比利时杜鹃花转录本数据库中筛选类黄酮生物合成通路关键酶类黄酮 3'-羟化酶基因序列信息并进行生物信息学分析,利用反转录(RT-PCR)技术克隆RhF3'H基因;利用紫外分光光度计测定了比利时杜鹃花花瓣不同时期的花青素含量,利用RT-qPCR技术对不同发育时期花瓣和成熟期的不同组织进行RhF3'H基因表达量分析;采用Gateway技术构建过表达载体35S:RhF3'H-GFP重组载体进行亚细胞定位验证;构建p1302-RhF3'H过表达载体对比利时杜鹃花花瓣进行侵染.[结果]成功获得比利时杜鹃花RhF3'H基因长度为 1 557 bp,编码 518 个氨基酸,具有保守的F3'H结构域,属于P450 超家族;系统进化树分析显示,比利时杜鹃花RhF3'H与龙眼和荔枝F3'H蛋白亲缘关系最近;RT-qPCR结果显示,RhF3'H在比利时杜鹃花不同花瓣时期和根、茎、叶组织中均有表达,在不同花瓣发育时期中,盛开期和衰败期中RhF3'H基因的表达量较高,与花青素含量结果相一致;亚细胞定位分析显示,RhF3'H主要存在于细胞膜上;成功构建P1302-RhF3'H瞬时过表达载体,相较于CK和p1302,p1302-RhF3'H在杜鹃花花瓣中显著高表达,其花青素含量也显著增加.[结论]RhF3'H基因在花瓣细胞膜中表达,表达模式与花青素积累趋势一致;过表达RhF3'H基因促进了花青素的合成.

比利时杜鹃是国外引种的具有较高观赏价值的园艺杂交品种.为进一步探讨外源激素对国外引进杜鹃品种扦插根系特征的影响,以当年生的半木质化枝条为材料,设置不同浓度植物生长调节剂,分析对杜鹃扦插生根过程中根系特征参数变化影响.结果表明:激素处理总体上对杜鹃扦插成活率、干物质积累、根系特征都有显著或极显著的影响,以100 mg·L-1和200 mg·L-1的IBA浓度对杜鹃插穗生长最有利;品种Marcel Menard、Marie Fortier根系特征参数整体上高于品种Roseum Elegance、Percy Wiseman,在产业化推广上具有一定优势;最长根长的变化与根表面积以及根体积呈显著的正相关,外源激素促进了插穗的成活率和不定根根系的生长,激素处理后插穗的根系参数明显高于对照.总之,插穗自身特性及外源激素调控在杜鹃扦插生根过程中扮演重要的角色,激素的使用对杜鹃的扦插繁殖具有一定的积极作用.

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是植物花青素合成过程中的关键酶,能够催化二氢黄酮醇生成无色花青素.该试验以红色和白色比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)不同器官和不同发育时期的花瓣为实验材料,利用反转录(RT-PCR)和RACE技术克隆RhDFR基因,利用植物酶联免疫试剂盒(ELISA)测定不同发育时期的花瓣RhDFR酶活性,利用qRT-PCR技术定量分析不同器官和不同发育时期的花瓣RhDFR基因,构建pET-28a-RhDFR原核表达载体对RhDFR蛋白进行制备和纯化,为进一步探究杜鹃花DFR基因功能以及花色的分子机理奠定基础.结果表明:(1)成功获得比利时杜鹃花RhDFR基因全长1253 bp,其开放阅读框1035 bp,编码344个氨基酸,含有1个NADPH结合保守基序和1个底物结合区域,具有高度保守性;系统进化分析显示,比利时杜鹃花RhDFR蛋白与越橘(Vaccinium corymbosum)DFR蛋白亲缘关系最近.(2)ELISA试剂盒分析显示,比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣DFR酶活性呈先上升后下降的趋势,并于红花初开期和白花盛开期的DFR酶活性最高.(3)qRT-PCR分析显示,不同器官中RhDFR基因的表达量为花瓣最高,雄蕊最低;不同发育时期的花瓣中,红色花的RhDFR基因表达量高于白色花.(4)成功构建原核表达载体pET-28a-RhDFR并诱导表达出大小约为38 kD的蛋白,与理论值相近.研究认为,杜鹃花中DFR酶活性的功能多样化,DFR基因与比利时杜鹃花花瓣的颜色有关.

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是植物花青素(anthocyanin)合成过程中的关键酶.本研究以红色比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)不同发育时期的花瓣为实验材料,利用反转录 PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和 cDNA 末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术对比利时杜鹃花黄烷酮 3-羟化酶(Rhododendron hybridum Hort.flavanone 3-hydroxylase,RhF3H)基因进行克隆,并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR技术对不同发育时期花瓣RhF3H基因表达量进行分析;构建pET-28a-RhF3H原核表达载体对RhF3H蛋白进行制备和纯化;构建pCAMBIA1302-RhF3H过表达载体,通过农杆菌介导法进行拟南芥遗传转化研究.结果表明,比利时杜鹃花RhF3H基因全长为1 245 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 092 bp,编码363个氨基酸,含有Fe2+结合基序和2-酮戊二酸结合基序的双加氧酶超家族.系统进化分析表明,比利时杜鹃花RhF3H蛋白与越橘F3H蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析表明,在不同发育时期花瓣中,红色比利时杜鹃花RhF3H基因的表达水平呈先上升后下降的趋势,在初开期表达量最高;原核表达结果表明,构建原核表达载体pET-28a-RhF3H诱导蛋白大小约为40 kDa,与理论值相近;成功获得转基因RhF3H拟南芥植株,PCR鉴定和β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)染色证明RhF3H基因整合到拟南芥植株基因组中.qRT-PCR、总黄酮和花青素含量分析显示,相对于野生型,RhF3H在转基因拟南芥植株中显著高表达,其总黄酮和花青素含量也显著增加.本研究为探究杜鹃花RhF3H基因功能提供一定的理论基础,对杜鹃花花色的分子机理有重要的研究价值.