目的 将叠氮溴化乙锭(EMA)与双重荧光PCR技术结合,建立EMA荧光PCR方法,快速检测食品中活性大肠杆菌O157∶H7.方法 在已建立大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的基础上,优化EMA作用浓度、时间;观察EMA对活菌扩增的影响;利用模拟样品和现行检测方法做比较.结果 30 μg/ml的EMA与细菌作用、曝光各15 min,可抑制4×106 CFU/ml O157∶H7死菌DNA的扩增;O157:H7活菌浓度＞4×105 CFU/ml时,EMA对活菌扩增有一定影响,离心可以降低其影响;活菌数/死菌数≥20％时,可以检出活菌;当活菌数量足够大时,死菌的存在不影响活菌的检出;EMA荧光PCR方法检测模拟样品,结果与现行的细菌分离培养金标准SN/T 0973-2010始终保持一致.结论 建立的EMA荧光PCR方法可准确鉴定活态大肠杆菌O157:H7,避免死菌DNA造成的假阳性,在食品检测中具有一定的应用价值.

本研究的目的是建立一种基于金属-生物分子骨架催化性能的快速定量检测牛奶中大肠杆菌0157:H7的新方法.以腺嘌呤和醋酸钴为原料,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂合成一种钴金属-生物分子骨架(Bio-MOF-11).对Bio-MOF-11的催化性能进行研究,发现Bio-MOF-11具有和辣根过氧化物酶(HRP)类似的催化活性,并能在无过氧化氢(H2O2)存在的情况下催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色.基于此建立一种通过磁性微球进行特异性富集,通过检测与靶标结合的Bio-MOF-11的量间接检测牛奶中大肠杆菌O157∶H7的方法,该方法的线性范围为3×103-6CFU/mL,检测限为8 CFU/mL,检测时间为25 min.该方法能快速,简单,高灵敏度、高选择性定量地检测出牛奶中的大肠杆菌O157∶H7,在食源性致病菌的快速筛查中具有重要的应用价值.

[背景]肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7和肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)O55∶H7是2株常见食源性致病菌,能导致腹泻及肠道外疾病,其特异性噬菌体具有制备新型抗菌制剂的应用前景.[目的]分离能特异裂解O157∶H7和O55∶H7的噬菌体,并分析其生物学特性和基因组特征,探索致病性大肠杆菌防控的抗生素替代方法.[方法]利用双层平板法从环境水样中分离噬菌体,对其形态、感染复数、宿主范围、一步曲线等生物学特性进行鉴定,使用Illumina MiSeq平台对其全基因组进行测序,利用RAST、Prokka、BLASTp等软件进行生物信息学分析.[结果]分别以E.coli O157∶H7和O55∶H7为宿主分离出2株特异性烈性噬菌体:vB_EcoM_P251和vB_EcoM_P255,均属于肌尾病毒科(Myoviridae).最佳感染复数均为1,在培养15 min内能以 91.9％和90.8％的速率吸附到宿主细胞上,而且在37-60℃、pH 4.0-11.0条件下保持高且稳定的活性;P251仅对大肠杆菌O157∶H7和O78∶H11菌株具有感染性,P255对O55∶H7、O157∶H7等11株不同血清型的EHEC和EPEC均具有感染性.P251基因组全长为136 254 bp,P255基因组全长为111 068 bp,GC含量分别为37％和35％;分别含有227、173个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中,80、73个ORF与已知功能基因具有显著相似性;P251还含有2个tRNA.比较基因组显示,P251和P255基因组在其48％的长度上共享72.24％的核苷酸同一性.[结论]分离鉴定了2株新的O157∶H7和O55∶H7噬菌体P251和P255,宿主范围广泛,具有防控食源性致病性大肠杆菌的潜力.

[目的]研究裂解酶Lysin1902与ε-聚赖氨酸(ε-PL)对大肠杆菌O157:H7的协同抗菌作用.[方法]通过Mega构建进化树、使用在线工具等分析大肠杆菌噬菌体裂解酶Lysin1902氨基酸序列组成和结构等;原核表达并纯化Lysin1902;通过平板裂解实验检测Lysin1902对大肠杆菌O157∶H7灭活菌株的裂解活性;用96孔板法检测Lysin1902或ε-PL的活菌裂解能力;棋盘法验证Lysin1902和ε-PL联用效果.[结果]体外成功表达并纯化了 Lysin1902.Lysin1902对大肠杆菌O157∶H7灭活菌株具有裂解活性,但不能有效裂解活的大肠杆菌.噬菌体裂解酶与ε-PL联用结果表明,加入Lysin1902后,ε-PL能够完全控制大肠杆菌O157∶H7增殖的使用浓度由0.7 mg/mL降低到 0.1 mg/mL.[结论]体外原核表达并纯化Lysin1902,其单独使用对活的大肠杆菌O157∶H7无裂解活性,但与ε-PL联用可显著提高ε-PL对大肠杆菌O157:H7的裂解能力.