目的:探讨血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶3(SGK3)在小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用,初步阐明SGK3在哺乳动物卵母细胞早期发育中的调控机制.方法:利用超排卵技术获取生发泡(GV)期小鼠卵母细胞,利用显微注射技术将表达质粒体外转录获得的SGK3 mRNA注射至GV期卵母细胞,分为对照组、Tris-EDTA缓冲液(TE)组和SGK3 mRNA组,采用Western blotting法检测各组小鼠卵母细胞中SGK3蛋白表达水平,显微注射SGK3 mRNA后1、2、3和4 h观察并计算各组卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率,采用SGK3抗体稀释抑制实验观察各组卵母细胞形态表现,采用Western blotting法检测体外培养不同时间点卵母细胞中磷酸化SGK3(pSer48)(SGK3-pSer48)和磷酸化细胞分裂周期蛋白2(CDC2)(pTyr15)(CDC2-pTyr15)蛋白表达水平.结果:与对照组和TE组比较,SGK3 mRNA组小鼠卵母细胞中 SGK3蛋白表达水平升高(P＜0.01),显微注射后1和2h时GVBD率升高(P＜0.01).SGK3抗体稀释抑制实验,随着SGK3抗体浓度增加,各组小鼠卵母细胞GVBD率呈浓度依赖性降低.过表达SGK3后,与对照组比较,SGK3 mRNA组小鼠卵母细胞中检测不到CDC2-pTyr15蛋白表达的时间至少提前1 h.不同稀释浓度SGK3抗体作用后,与对照组比较,随着SGK3抗体浓度升高和时间的延长,小鼠卵母细胞中CDC2-pTyr15蛋白表达水平逐渐降低(P＜0.01),SGK3-pSer486蛋白表达水平逐渐升高(P＜0.01).结论:过表达SGK3可以增加小鼠卵母细胞GVBD率,加快CDC2-pTyr15的脱磷酸化,而CDC2-pTyr15的脱磷酸化晚于SGK3-Ser486的磷酸化.SGK3可能作为CDC2上游调节因子参与调控小鼠卵母细胞第一次减数分裂的恢复.

目的:检测小鼠各期卵母细胞中血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶3(SGK3)mRNA和蛋白的表达及其亚细胞定位,为阐明SGK3 对小鼠卵母细胞周期变化的调控作用机制提供依据.方法:通过超排卵技术收集小鼠生发泡(GV)期、生发泡破裂(GVBD)期、第 1 次减数分裂(MⅠ)期卵母细胞和第2次减数分裂(MⅡ)期卵母细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blotting法检测各期小鼠卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平,收集GV、GVBD和MⅠ期卵母细胞后采用Western blotting法检测小鼠各期卵母细胞中Cdc25B-Ser30的磷酸化表达情况,免疫荧光法观察小鼠各期卵母细胞中SGK3亚细胞定位情况.结果:在小鼠各期卵母细胞中均有SGK3 mRNA和蛋白表达.与GV期比较,GVBD和MⅡ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01);与GVBD期比较,MⅠ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),MⅡ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01);与MⅠ期比较,MⅡ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01).Cdc25B-Ser30在GV期被去磷酸化,在GVBD和MⅠ期被磷酸化.小鼠的GV期卵母细胞中SGK3定位于细胞核膜,在GVBD期前进入细胞核,在GVBD期定位于细胞核,MⅠ期则分布于整个细胞,在MⅡ期则由细胞浆再次进入细胞核.结论:小鼠各期卵母细胞中SGK3均呈动态表达,SGK3存在核浆穿梭,SGK3定位的动态变化可能参与了细胞周期B的激活.

目的 研究小鼠卵母细胞减数分裂进程中活化的LIMK1(pLIMK1Thr508)与Aurora-A亚细胞分布的相关性, LIMK1活性变化对Aurora-A和纺锤体组装的影响.方法 收集21日龄CB6F1小鼠卵母细胞,分别体外培养至生发泡期(GV)、生发泡破裂期(GVBD)、第1次减数分裂中期(MI)、第1次减数分裂后期(AI)和末期(Tel I)以及第2次减数分裂中期(MII),固定并利用免疫荧光染色法分析减数分裂进程中pLIMK1Thr508的亚细胞定位模式及其与纺锤体组装调控因子Aurora-A的时空相关性;利用抑制剂BMS-3处理MI期细胞,结合免疫荧光染色分析LIMK1活性缺失对于Aurora-A空间分布和纺锤体形成的影响.结果 在小鼠卵母细胞减数分裂前期(prophase)(即GV期), pLIMK1Thr508信号微弱并主要聚集于生发泡,此时 Aurora-A 在胞内没有特殊聚集;在临近减数分裂重启时, pLIMK1Thr508离开生发泡,Aurora-A 信号出现,两者呈高度致密的点状聚集并紧密重合;在生发泡完全破裂后, pLIMK1Thr508和Aurora-A又呈多个点片状聚集在凝集的染色体周围;在MI期和MII期,pLIMK1Thr508与Aurora-A共同定位于纺锤体两极;在从AI期到Tel I期进程中pLIMK1Thr508离开纺锤体两极,聚集在收缩环部位,Aurora-A在纺锤体两极有微弱聚集.LIMK1抑制剂BMS-3能够破坏 Aurora-A在纺锤体两极的聚集,并影响纺锤体结构.结论 pLIMK1Thr508在卵母细胞减数分裂中是一种微管组织中心(MTOC)相关蛋白,可能通过调控Aurora-A而参与纺锤体结构的形成和维持.

目的 研究新型微管蛋白ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂进程中的蛋白表达、亚细胞定位及其与纺锤体的相关性.方法 用Western blot法检测ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期的蛋白表达;免疫荧光染色分析ε-tubulin在减数分裂进程中的亚细胞定位模式及其与纺锤体的相关性.结果 ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期均有稳定的蛋白表达,在减数分裂前期均匀分布在细胞核中,在生发泡破裂后直到第二次减数分裂中期始终保持与纺锤体微管的共定位特性,并持续存在于染色体上.ε-tubulin对纺锤体毒性药物Taxol和Nocodazole敏感并呈现出与微管一致的反应性.结论 小鼠卵母细胞内新型微管蛋白ε-tubulin稳定表达并与纺锤体的组装和维持相关.

Ran结合蛋白1(RanBP1)的时空分布和表达量对有丝分裂纺锤体的正确组装至关重要,然而RanBP1在小鼠卵母细胞成熟过程中的作用尚不清楚.本研究通过免疫荧光技术系统地分析了RanBP1在小鼠卵母细胞以及早期胚胎中的定位,并利用显微注射技术在生发泡(GV)期卵母细胞中分别注入靶向Ranbp1的Morpholino和编码Ranbp1的mRNA实现对RanBP1表达量的下调和上调,研究RanBP1对卵母细胞成熟的影响.试验结果显示在卵母细胞以及早期胚胎中RanBP1主要弥散分布在整个细胞质中,细胞核中很少.当有纺锤体形成时,RanBP1在纺锤体区域有明显的浓集.RanBP1表达量异常的卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率降低(P＜0.01),第一极体排出率降低(P＜0.05).尽管仍有高于70％的卵母细胞能够完成GVBD并成功排出第一极体,但是成熟到减数分裂Ⅱ(MⅡ)期的卵母细胞中纺锤体形态以及染色体排布异常率高于64％.纺锤体微丝减少且形态异常没有明确的规律,染色体的排布杂乱无章且出现滞后、凝集等现象,表明RanBP1表达量的异常抑制卵母细胞的成熟.该研究证实RanBP1精确的表达在小鼠卵母细胞成熟纺锤体形成以及染色体正确分裂中发挥着重要作用,为探究配子发生过程中染色体分离缺陷和克隆胚胎发育效率低的原因以及提高体细胞核移植克隆效率提供了新的依据.

目的 通过观察泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)点突变蛋白与野生型蛋白过量对小鼠卵母细胞成熟的影响,并分析其在小鼠卵母细胞离体成熟过程中的作用及作用方式.方法 通过原核重组蛋白技术制备UCHL1点突变(C90S和I93M)和野生型蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,通过显微注射技术将UCHL1野生型蛋白与GST的融合蛋白、UCHL1点突变蛋白与GST的融合蛋白、GST、PBS分别注射到小鼠未成熟卵母细胞,或在体外培养基中添加UCHL1野生型蛋白与GST的融合蛋白,分析野生型UCHL1过量、UCHL1(I93M)点突变蛋白添加及泛素水解酶活性缺失的UCHL1(C90S)点突变蛋白添加对卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率的影响.分离UCHL1(I93M)点突变小鼠与野生型小鼠的生发泡期卵母细胞,体外培养3 h后比较其GVBD率.结果 显微注射UCHL1野生型蛋白及其点突变体与GST的融合蛋白的各组之间、注射GST组、注射PBS组卵母细胞GVBD率差异均无统计学意义,在培养基中添加UCHL1蛋白与GST的融合蛋白组卵母细胞GVBD率与无注射无添加对照组相比差异也无统计学意义(P均>0.05).注射UCHL1(C90S)与GST的融合蛋白组有少量生发泡期卵母细胞体外发育为MⅡ期卵母细胞后呈现极体较对照组偏大的现象.UCHL1(I93M)点突变小鼠生发泡期卵母细胞体外GVBD率与野生型小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 在小鼠卵母细胞中添加外源性UCHL1、有致病作用的UCHL1(I93M)突变体或泛素水解酶活性丧失的UCHL1(C90S)突变体均不影响卵母细胞成熟的GVBD进程,UCHL1(I93M)点突变小鼠卵母细胞GVBD率亦无异常,但UCHL1(C90S)点突变可能影响极体的形成.

目的 短链脂肪酸(SCFAs)对卵母细胞体外成熟的作用及其可能的机制尚不明确.文中探讨短链脂肪酸对小鼠卵母细胞体外诱导氧化应激后发育成熟的影响及其作用机制. 方法 收集6～8周龄ICR雌鼠生发泡(GV)期的卵母细胞,分为对照组(不干预)、H2O2处理组(50μmol/L H2O2处理1.5 h)、H2O2+乙酸组(50μmol/L H2O2处理1.5 h后,1 mmol/L乙酸干预)、H2O2+丙酸组(50μmol/L H2O2处理1.5 h后,10μmol/L丙酸干预)和H2O2+丁酸组(50μmol/L H2O2处理1.5 h后,2μmol/L丁酸干预).并于培养3 h后观察生发泡破裂(GVBD)率,于培养16 h后观察第一极体排出(PBE)率;免疫荧光化学染色法检测体外培养9 h进入第一次减数分裂中期(MI期)和16 h排出第一极体进入第二次减数分裂中期(MII期)的卵母细胞内染色体的排列和纺锤体的形态;Western blot检测不同处理组Pi3k/Akt通路相关蛋白表达量. 结果 成熟率结果显示,与对照组GVBD率[(86.87±1.76)％]和PBE率[(85.37±1.98)％]相比,H2O2处理组[(66.73±1.25)％、(50.57±4.22)％]明显下降(P<0.05),而与H2O2处理组相比,H2O2+乙酸组[(80.67±2.62)％、(78.07±1.78)％],H2O2+丙酸组[(74.50±2.91)％、68.03±1.84)％]和H2O2+丁酸组[(75.93±2.12)％、(66.40±3.46)％]卵母细胞的成熟率显著改善(P<0.01).免疫荧光结果显示,在添加了SCFAs的M2培养液中成熟的卵母细胞减数分裂的超微结构较H2 O2处理组明显改善,主要体现在染色体排列和纺锤体形态的改变.Western blot结果显示,H2 O2处理组卵母细胞中的p-Akt和Akt蛋白表达量的比值较对照组明显增多(P<0.01),而H2 O2+乙酸组和H2 O2+丙酸组较H2 O2处理组明显降低(P<0.01). 结论 在体外培养液中添加短链脂肪酸可以改善氧化应激后小鼠卵母细胞的发育潜能,为改善体外氧化应激诱导的卵母细胞成熟障碍提供新思路.