目的:探讨过表达破骨细胞刺激性转膜蛋白（osteoclast stimulatory transmembrane protein，OC-STAMP）对上皮-间质转化的作用及机制。方法:于2021年4月，将小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12细胞分为过表达对照组（NC组）、 Ocstamp过表达组（over- Ocstamp组）、法舒地尔（Fasudil）干预组（over- Ocstamp+Fasudil组）、沉默对照组（si-NC组）、 Ocstamp沉默组（si- Ocstamp组）。采用蛋白免疫印迹（Western blotting）法、免疫细胞化学染色法检测OC-STAMP、上皮标志蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）、间质标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ras基因家族成员A（Ras homolog gene family member A，RhoA）、Rho GDP解离抑制因子α（Rho GDP dissociation inhibitor α，Rho GDIα）、Rho相关蛋白激酶（Rho-associated protein kinase，ROCK）、磷酸化肌球蛋白磷酸酶（phosphate myosin phosphatase，p-MYPT）蛋白表达，采用鬼笔环肽法检测细胞骨架肌动蛋白（filamentous actin，f-actin）的变化。采用 t检验比较两组间各蛋白的相对表达量。 结果:Western blotting及免疫细胞化学染色法结果显示，与NC组比较，over- Ocstamp组E-cad蛋白表达下调，α-SMA、Rho GDIα、RhoA、ROCK、p-MYPT蛋白表达增加，F-actin表达增强，差异均有统计学意义（ P<0.05）；与si-NC组比较，si- Ocstamp组E-cad和α-SMA蛋白表达差异均无统计学意义（ P>0.05）；与over- Ocstamp组比较，over- Ocstamp+Fasudil组E-cad蛋白表达上调，α-SMA、Rho GDIα、RhoA、ROCK、p-MYPT蛋白表达下降，F-actin表达减弱，差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:肺泡Ⅱ型上皮细胞过表达OC-STAMP，可能通过激活Rho GDIα/RhoA/ROCK信号通路，诱导肌动蛋白细胞骨架重塑，进而促进上皮-间质转化。

[背景]破骨细胞刺激性跨膜蛋白(OC-STAMP)参与二氧化硅(SiO2)暴露引起矽肺纤维化,其通过诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞铁死亡从而参与矽肺纤维化的作用及相关机制尚不明确.[目的]探讨SiO2 暴露下OC-STAMP调控肺泡Ⅱ型上皮细胞铁死亡参与大鼠矽肺纤维化的作用及可能机制.[方法]20只SPF级Wistar雄性大鼠,随机分为 2组,每组 10只,分别为对照组(Sham组)、SiO2 组.SiO2 组大鼠通过气管非暴露法一次性给予 1 mL 50 mg·L-1 的SiO2 混悬液建立矽肺动物模型,Sham组大鼠采用同样的方法给予 1 mL 0.9%氯化钠溶液,8周后处死大鼠.取左下肺固定于戊二醛或多聚甲醛,用透射电镜观察线粒体超微结构;用HE染色、Masson染色、VG染色及普鲁士蓝染色显示肺组织结构变化及铁沉积状况.通过免疫组化和免疫荧光评价OC-STAMP表达水平和肺纤维化程度.采用实时荧光定量 PCR检测大鼠肺组织 OC-STAMP表达水平及验证OC-STAMP的转染效果.培养MLE-12细胞,通过转染OC-STAMP质粒或OC-STAMP小干扰RNA(siRNA)构建过表达(OCS组)和抑制表达(SI-OC组)模型.采用Western blotting法检测肺组织及MLE-12中谷胱甘肽过氧化物酶 4(GPX4)、溶质载体家族 7成员11(SLC7A11)等蛋白的相对表达量.[结果]SiO2 暴露 8周后,HE、Masson和VG染色结果显示造模成功;组织免疫荧光结果显示,OC-STAMP与ATP结合盒亚家族A成员 3(ABCA3)共定位于肺泡Ⅱ型上皮中;免疫组化结果显示,SiO2 组OC-STAMP、Ⅰ型胶原表达水平与Sham组相比升高(P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示,SiO2 组肺组织中OC-STAMP的mRNA高于Sham组(P<0.01);肺组织普鲁士蓝染色结果显示在SiO2 组可见阳性棕黄色颗粒;经透射电镜观察,Sham组线粒体结构正常,SiO2组线粒体普遍肿胀,线粒体嵴溶解、消失;肺组织免疫印迹结果显示,在SiO2 组,SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低(P<0.05,P<0.01),Vimentin蛋白表达水平增加(P<0.01);在转染的MLE-12细胞中,与Sham组相比,OCS组SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低(P<0.01,P<0.01).[结论]OC-STAMP可能通过影响铁死亡相关蛋白表达,从而促进SiO2 暴露导致的肺纤维化.

目的 研究过表达Ocstamp对MLE-12细胞基因表达的影响.方法 构建稳定过表达Ocstamp和空载对照(NC)的MLE-12细胞并进行高通量转录组测序和生物信息学分析.蛋白免疫印迹法检测p-毛细血管扩张性共济失调突变激酶(ATM)、p-毛细血管扩张性共济失调(ATR)、p-p53、p21、p16、Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅲ)、Ⅺ型胶原蛋白(Col Ⅺ)、己糖激酶2(HK2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、磷酸果糖激酶1(PFK1)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)的表达,β半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老.结果 高通量转录组测序结果显示,与NC组相比,过表达Ocstamp的MLE-12细胞中有2 794个差异基因,其中GO分析和KEGG分析显示衰老信号、糖酵解信号和胶原沉积信号出现了异常激活,蛋白免疫印迹结果显示,与NC组相比较,p-ATM、p-ATR、p-p53、p21、p16、Col Ⅰ、ICol Ⅲ、Col Ⅺ、HK2、LDHA、PFK1、PKM2 在 Ocstamp 过表达组中均上调(P＜0.05),且β半乳糖苷酶染色阳性.结论 过表达Ocstamp能介导MLE-12细胞衰老信号、糖酵解信号和胶原沉积等异常活化.