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皂角豆象成虫触角转录组及嗅觉相关基因分析
编辑人员丨1天前
[目的]本研究旨在建立皂角豆象Megabruchidius dorsalis雌雄成虫触角转录组数据库,挖掘皂角豆象嗅觉相关基因.[方法]采用高通量测序平台Illumina HiSeq对皂角豆象雌雄成虫触角进行转录组测序、序列组装、功能注释及差异表达基因分析;通过qRT-PCR技术测定和验证皂角豆象雌雄成虫触角中部分高丰度表达基因的表达量.[结果]皂角豆象雌雄成虫触角转录组共获得42 053条 unigenes,N50 长度为 2 066 bp.与 NR,Swiss-Prot,Pfam,eggNOG,GO 和 KEGG 六大公共数据库比对共注释到18 039条unigenes(占43.57%),其中注释到NR数据库的unigenes数量最多,为17 687条;注释到KEGG数据库的unigenes数量最少,为9 779条.依据注释信息分析,鉴定出183个皂角豆象候选嗅觉相关基因,包括25个气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因、3 个化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因、126 个气味受体(odorant receptor,OR)基因(包括125个典型OR基因和1个非典型OR基因)、8个离子型受体(ionotropic receptor,IR)基因、18个味觉受体(gustatory receptor,GR)基因和3个感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因.通过比较皂角豆象雌雄成虫触角转录组,共筛选出357个差异表达基因,其中包含8个OR基因和1个IR基因;这357个差异表达基因中,152个基因在雌性触角中高表达,205个基因在雄性触角中高表达.此外,qRT-PCR验证结果显示,6个嗅觉相关基因(MdorCSP3,MdorIR2,MdorIR6,MdorGR10,MdorSNMP2和MdorSNMP3)在皂角豆象雌成虫触角中高表达,4个嗅觉相关基因(MdorOBP1 5,MdorOBP22,MdorORco和MdorGR8)在雄成虫触角中高表达.[结论]本研究获得了皂角豆象成虫触角转录组数据,并鉴定筛选出候选嗅觉相关基因,结果为进一步研究皂角豆象的基因功能及嗅觉感受机制奠定分子基础.
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编辑人员丨1天前
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热疗调控TPX2表达诱导胆管癌细胞的凋亡研究
编辑人员丨1天前
目的:探讨热疗调控TPX2表达诱导胆管癌细胞的凋亡机制。方法:在不同温度(37 ℃、40 ℃、43 ℃和46 ℃)下处理后,检测胆管癌细胞RBE的凋亡水平和细胞活力。热疗处理后,转录组高通量测序和siRNA筛选鉴定热疗调控胆管癌细胞RBE凋亡的关键分子。结果:随着温度升高(37 ℃、40 ℃、43 ℃和46 ℃),胆管癌细胞的活力降低( P<0.05),坏死的胆管癌细胞随着温度的升高而增加( P<0.05),细胞凋亡水平在43 ℃时达到峰值(6%±1%, P<0.05)。当敲低TPX2时,胆管癌细胞的凋亡水平上升(47%±3%比74%±3%, P<0.05)。过表达TPX2时,胆管癌细胞的凋亡水平下降(45%±3%比21%±4%, P<0.05)。热疗显著降低了TPX2、PI3K、p-PI3K和P-AKT的表达水平( P<0.05),并增加了p21的表达和caspase3的切割( P<0.05);敲低TPX2后,PI3K、p-PI3K和p-AKT的表达水平显著下降( P<0.05),p21的表达水平显著上升( P<0.05);过表达TPX2后,PI3K和p-AKT的表达水平显著上升( P<0.05),p21的表达水平显著下降( P<0.05)。 结论:热疗通过影响TPX2的表达,抑制了PI3K/AKT通路活性,减少了胆管癌细胞的细胞活力,促进了胆管癌细胞的凋亡。
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编辑人员丨1天前
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基于生物信息学分析识别老年骨质疏松症核心致病基因及通路
编辑人员丨1天前
目的:采用生物信息学方法分析老年骨质疏松症相关的核心致病基因及相关通路。方法:于2020年11月至2021年8月,以在北京积水潭医院就诊的8例骨质疏松症病例和5名健康体检者为研究对象。采集8例老年骨质疏松症患者与5名健康体检者的外周血,开展高通量转录组测序,并对表达谱进行分析。对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。通过 STRING、Cytoscape 工具构建 PPI 调控网络、筛选核心基因。结果:8例骨质疏松症病例中,男性1例,女性7例,年龄为(72.4±4.2)岁;5名健康体检者中,男性1名,女性4名,年龄为(68.2±5.7)岁。分析筛选出差异表达基因1 635个,其中847个基因高表达,788个基因低表达。GO富集分析结果显示,差异基因在分子功能方面主要富集于核糖体结构成分、蛋白质二聚化活性等;细胞组分方面主要富集于核小体、DNA组装复合物、胞质部分、蛋白-核酸复合物、游离核糖体等。KEGG信号通路分析结果显示,差异表达基因主要富集于系统性红斑狼疮、核糖体等。筛选出的10个核心基因分别为 UBA52 、UBB、RPS27 A、RPS15 、RPS12 、RPL13 A、RPL23 A、RPL10 A、RPS25和 RPS6,且其中7个基因均可编码核糖体蛋白。 结论:老年骨质疏松症的发病可能与核糖体相关基因和通路有关联。
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编辑人员丨1天前
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单细胞测序技术在遗传生殖诊断中的应用进展
编辑人员丨1天前
胚胎植入前产前诊断技术在辅助生殖中得到了很大发展,特别为遗传物质异常人群提供了优生优育的技术可能。单细胞测序作为新兴的测序技术,可以从单个细胞的层面解析细胞的基因组和转录组等组学问题,能够反映细胞间的异质性,从而有利于揭示疾病发生发展的机制。通过胚胎植入前产前诊断,应用胚胎活检获得的单个细胞进行高通量测序,可有效检出胚胎染色体的整倍性,对单核苷酸多态(SNP)和染色体拷贝数变异(CNV)也有较好的检出作用,可以应用于基因组多态性及致病变异的检测和研究。介绍了单细胞测序技术和方法,总结了单细胞测序在遗传生殖诊断中的研究现状,阐述了该技术在遗传生殖领域的应用进展,探讨了该技术的未来发展方向。
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编辑人员丨1天前
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骨肉瘤组织中circ_0000880表达及其对细胞增殖的影响
编辑人员丨1天前
目的:观察骨肉瘤组织和细胞株中环状RNA circ_0000880表达,及其对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:选取经病理确诊的骨肉瘤的标本共16例,采用circRNA高通量测序技术检测表达差异的circRNA。提取骨肉瘤及其癌旁组织总RNA,依据circ_0000880序列,设计divergent primer,扩增包含backsplice junction区域片段,随后连接入pGM-T载体进行测序鉴定。采用SYBR Green荧光定量PCR,分别检测骨肉瘤及其癌旁组织,骨肉瘤细胞MG63、SAOS-2、U2OS及正常人成骨细胞hFOB1.19中circ_0000880的表达水平。将circ_0000880小干扰RNA(siRNA)和circ_0000880 NC慢病毒转染至骨肉瘤细胞后检测细胞中circ_0000880的表达水平,并通过细胞计数试剂盒(CCK-8)及克隆形成实验检测对骨肉瘤细胞增殖的影响。两样本两组间比较用 t检验。 结果:采用circRNA高通量测序技术检测结果显示骨肉瘤组织及细胞中circ_0000880的表达显著上调,并通过测序鉴定证实circ_0000880在骨肉瘤组织中存在、且为环状RNA。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果显示circ_0000880在骨肉瘤组织中的表达量(2.032±0.165)显著高于其癌旁组织(1.105±0.155, t=16.393, P<0.05)。circ_000088在骨肉瘤细胞系MG63(2.252±0.140)、SAOS-2(2.134±0.176)、U2OS(2.011±0.226)中表达量均显著高于正常人成骨细胞(1.000±0.092, F=71.299, P<0.05)。转染circ_0000880 siRNA的MG63细胞中circ_0000880表达量明显下降(0.646±0.058),转染circ_0000880 NC的MG63细胞中circ_0000880表达水平(1.005±0.121)与空白组(1.000±0.201)比较差异无统计学意义( F=17.977, P<0.05)。CCK-8及克隆形成试验结果显示,与空白组和阴性对照组比较,转染circ_0000880 siRNA的骨肉瘤细胞增殖能力显著受到抑制。 结论:骨肉瘤组织及细胞中circ_0000880表达显著上调,敲低circ_0000880表达可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖能力。
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编辑人员丨1天前
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脓毒症儿童的肠道菌群特征及益生菌的干预作用
编辑人员丨1天前
目的:分析脓毒症儿童肠道菌群特征及益生菌的干预作用。方法:采用前瞻性观察性研究方法,纳入收住我院儿童重症医学科(PICU)的脓毒症患儿34例随机分为两组,一组予以常规治疗(常规组,A组, n=17),另一组在常规治疗基础上添加益生菌辅助治疗(益生菌组,B组, n=17),同时选取健康儿童20例作为对照组(C组)。入组24 h内记录所有脓毒症患儿的一般情况及序贯器官衰竭评分(SOFA),并于入组后5~7 d,采集患儿的粪便样本,同期留取健康患儿粪便样本,运用高通量16S rRNA基因测序技术进行肠道菌群检测,进行生物信息学分析并预测肠道菌群功能,比较组间差异。 结果:α多样性指数及β多样性指数分析显示,两组脓毒症患儿肠道菌群的丰度均较健康儿童明显下降,同时菌群的个体差异也呈加大趋势,但是服用益生菌后,上述指标得到了显著改善( P<0.05);在菌门水平上,常规治疗组的拟杆菌门和放线菌门比例最低,变形菌门的数量明显增加( P<0.05);在菌属水平上,肠球菌成为常规治疗组中的优势菌种,而在益生菌组中双歧杆菌、普氏粪杆菌及丹毒丝菌、扭链胃球菌的比例明显提高( P<0.05);益生菌组与常规组相比,两者在线粒体合成、外泌体、mRNA转录降解及半胱氨酸代谢等通路的丰度存在明显差异。 结论:脓毒症儿童肠道菌群的多样性下降,结构稳定性差,同时拟杆菌减少伴变形杆菌增多,而添加益生菌辅助治疗后可增加患儿双歧杆菌及普氏粪杆菌等有益菌的比例,减少肠球菌等机会致病菌的数量,其差异性代谢通路可能与益生菌的作用机制相关。
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编辑人员丨1天前
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基于单细胞转录组测序探讨小鼠脉络膜新生血管内皮细胞的病理特征
编辑人员丨1天前
目的:基于单细胞转录组测序(scRNA-seq)探讨小鼠脉络膜新生血管(CNV)中内皮细胞(EC)的分子表达与病理特征。方法:取6只6~8周龄C57BL/6小鼠按照随机数字表法随机分为2个组,每组3只,处死后摘取双眼眼球,分别采用剪碎脉络膜巩膜复合体法和刮取脉络膜法分离脉络膜组织,采用胰蛋白酶/Ⅰ型胶原酶37 ℃连续消化制得单细胞悬液,流式细胞术检测细胞活率及EC比例,确定单细胞悬液制备方法。选取6只小鼠随机分为正常对照组和CNV组,每组3只,其中CNV组小鼠建立激光诱导的CNV模型;于造模后7 d制备单细胞悬液,采用10xGenomics进行单细胞分离并构建测序文库,Illumina Novaseq6000进行高通量测序,获得基因表达矩阵;根据文献报道并参考Cellmarker数据库定义细胞亚群;选取EC亚群进行拟时序分析,生成各个细胞分化状态(State)的基因表达矩阵,筛选CNV-EC并初步分析表达特征。另选取6只小鼠建立CNV模型,于造模后7 d取小鼠眼球制备冰冻切片,免疫荧光染色检测EC标志物Pecam1与线粒体外膜蛋白Tomm20、mt-Co1和毛细血管标志物Kdr、Plvap的共定位及面积占比情况,并统计血管直径。结果:剪碎复合体和刮取脉络膜所制备单细胞悬液的细胞活率分别为99.4%和99.1%,符合测序要求;流式细胞术检测EC占比约为1.58%。scRNA-seq结果显示,正常对照组和CNV组小鼠脉络膜均包含13个细胞亚群,与正常对照组比较,CNV组视锥/视杆细胞、EC和造血系细胞比例增加,视网膜色素上皮(RPE)细胞和施万细胞比例相应减少。在所有细胞亚群中,EC比例为18.40%。EC拟时序分析显示,脉络膜EC可分为4个State,CNV组中位于State 2状态的EC比例为29.1%,较正常对照组的9.5%明显升高;差异基因分析显示,State 2 EC中线粒体相关基因 mt-Nd4和 mt-Atp6等表达上调而毛细血管基因 Kdr和 Esm1等表达显著下调。免疫荧光染色结果显示,CNV区域内Tomm20和mt-Co1在Pecam1阳性EC内表达分布面积比例分别为(19.50±4.68)%和(4.64±2.82)%,明显高于正常区域的(3.00±2.09)%和(0.18±0.34)%,差异均有统计学意义( t=7.88、3.84,均 P<0.01)。CNV区域内Kdr和Plvap在Pecam1阳性EC内表达面积比例分别为(1.50±0.29)%和(0.79±0.97)%,明显低于正常区域的(31.30±5.44)%和(10.43±2.28)%,差异均有统计学意义( t=13.40、9.48,均 P<0.01)。CNV区域血管直径为(5.52±1.85)μm,明显大于正常区域的(4.21±1.84)μm,差异有统计学意义( t=9.57, P<0.001)。 结论:CNV发生时,脉络膜组织中EC比例增加,CNV-EC呈现线粒体代谢活化和毛细血管特性丢失的病理特征,提示EC线粒体活化可能在CNV生成中具有一定的作用。
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编辑人员丨1天前
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Krüppel样因子4对脓毒症小鼠炎症反应与脏器损伤的作用
编辑人员丨1天前
目的:探讨Krüppel样因子4(KLF4)在巨噬细胞炎症反应中的表达特点与作用及其对脓毒症小鼠炎症反应与脏器损伤的作用,为烧创伤脓毒症的靶向治疗奠定理论基础。方法:采用实验研究方法。取小鼠RAW264.7巨噬细胞与从10只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠中提取的原代腹腔巨噬细胞(PM)进行实验。采用内毒素/脂多糖(LPS)分别处理RAW264.7巨噬细胞与PM 0(未处理)、1、2、4、6、8、12、24 h构建巨噬细胞炎症反应模型,采用实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、CC趋化因子配体2(CCL2)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达,据此确定后续部分实验LPS处理时间。用LPS处理RAW264.7巨噬细胞0、8 h,采用免疫荧光法检测KLF4的定位与蛋白表达;利用高通量测序技术平台对细胞进行转录组测序,采用DESeq2软件筛选2种处理时间细胞间的差异表达基因(DEG)。采用LPS分别处理RAW264.7巨噬细胞与PM 0、1、2、4、6、8、12、24 h,分别用实时荧光定量RT-PCR法与蛋白质印迹法检测KLF4的mRNA与蛋白表达。将RAW264.7巨噬细胞按随机数字表法分为阴性对照组与KLF4过表达组,分别转染对应质粒后用LPS处理0、8 h,采用实时荧光定量RT-PCR法检测KLF4、IL-1β、IL-6、CCL2与TNF-α的mRNA表达,采用蛋白质印迹法检测KLF4蛋白表达。前述实验样本数均为3。将40只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为KLF4过表达组和阴性对照组(每组20只),分别注射相应转染注射液后构建盲肠结扎穿孔脓毒症模型。采用随机数字表法从2组小鼠中各选取12只,观察建模后72 h内生存情况。于建模后8 h取2组分别剩余的8只小鼠,先行眼球取血,采用酶联免疫吸附测定法检测血清中IL-1β、IL-6水平,采用干化学法检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平;后取心脏、肺脏、肝脏组织,行苏木精-伊红染色后观察损伤情况。对数据行独立样本 t检验、Cochran&Cox近似 t检验、单因素方差分析、Dunnett检验、Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析、Dunnett T3检验、log-rank(Mantel-Cox)检验。 结果:与LPS处理0 h比较,LPS处理6 h与8 h RAW264.7巨噬细胞中IL-1β mRNA表达、LPS处理4~12 h RAW264.7巨噬细胞中IL-6 mRNA表达、LPS处理8 h和12 h RAW264.7巨噬细胞中CCL2 mRNA表达以及LPS处理4~8 h RAW264.7巨噬细胞中TNF-α mRNA表达均显著上调( P<0.05或 P<0.01),LPS处理4~8 h PM中IL-1β与CCL2 mRNA表达、LPS处理2~24 h PM中IL-6 mRNA表达以及LPS处理2~12 h PM中TNF-α mRNA表达均显著上调( P<0.05或 P<0.01)。选取8 h作为后续部分实验的LPS处理时间。KLF4主要定位在RAW264.7巨噬细胞的细胞核中。与LPS处理0 h比较,LPS处理8 h RAW264.7巨噬细胞中KLF4蛋白表达明显减少;LPS处理8 h RAW264.7巨噬细胞中有1 470个差异表达显著的DEG,包括转录表达显著下调的 KLF4[错误发现率<0.05,log 2(差异倍数)=-2.47]。与LPS处理0 h比较,LPS处理6~24 h RAW264.7巨噬细胞中KLF4 mRNA表达、LPS处理1~24 h RAW264.7巨噬细胞与PM中KLF4蛋白表达以及LPS处理4~24 h PM中KLF4的mRNA表达均明显降低( P<0.05或 P<0.01)。与阴性对照组比较,KLF4过表达组LPS处理0、8 h RAW264.7巨噬细胞中KLF4的mRNA( t'值分别为17.03、8.61, P<0.05或 P<0.01)与蛋白表达均明显升高,LPS处理0 h RAW264.7巨噬细胞中IL-6、CCL2的mRNA表达均明显升高( t值分别为6.29、3.40, P<0.05或 P<0.01),LPS处理8 h RAW264.7巨噬细胞中IL-1β、IL-6、CCL2、TNF-α的mRNA表达均显著下降( t值分别为10.52、9.60、4.58、8.58, P<0.01)。KLF4过表达组小鼠建模后72 h内生存比例明显高于阴性对照组( χ2=4.01, P<0.05)。建模后8 h,KLF4过表达组小鼠血清中IL-1β、IL-6与ALT、AST水平分别为(161±63)、(476±161)pg/mL与(144±24)、(264±93)U/L,明显低于阴性对照组的(257±58)、(654±129)pg/mL与(196±27)、(407±84)U/L( t值分别为3.16、2.44与4.04、3.24, P<0.05或 P<0.01)。建模后8 h,与阴性对照组比较,KLF4过表达组小鼠心脏、肺脏、肝脏的组织结构紊乱减轻,炎性渗出明显减少,脏器实质细胞病理样改变明显减轻。 结论:KLF4在LPS诱导的巨噬细胞炎症反应中表达显著下降,显著抑制巨噬细胞炎症反应;KLF4显著提高脓毒症小鼠生存率并缓解炎症反应与脓毒症相关脏器损伤。
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编辑人员丨1天前
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一个Smith-Lemli-Opitz综合征家系的临床表型和遗传学分析
编辑人员丨1天前
目的:报道一个中国Smith-Lemli-Opitz综合征家系的临床表型和致病基因变异,并探讨儿童早期诊断的重要性。方法:收集该家系成员的临床资料,抽取外周血基因组DNA,应用高通量测序进行全外显子组检测,对候选基因变异位点进行Sanger测序验证,并提取先证者及其父母外周血RNA进行反转录测序验证。结果:先证者和家系中另一例患儿均表现有智力和运动障碍、小头畸形、小下颌、鼻孔前翻、双足2/3并趾。先证者还有尿道下裂、单一上切牙、血清胆固醇水平降低的表现,其中单一上切牙为该患儿特有的表型;2例患儿均为 DHCR7基因父源c.278C>T(p.T93M)变异和母源c.907G>A (p.G303R)变异,二个变异是已知的致病变异,表型正常的姐姐是p.T93M变异携带者。 结论:DHCR7基因的复合杂合变异c.278C>T(p.T93M)和c.907G>A (p.G303R)是引起该家系患儿发病的遗传学病因,提高对本病的认识有助于其早期诊断和治疗。
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编辑人员丨1天前
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环状RNA PNN在肝细胞癌中表达及其机制
编辑人员丨1天前
目的:探讨Circ PNN(Circ PNN/hsa_Circ_0101802)在肝癌细胞中的表达,对肝癌细胞增殖和凋亡影响,以及调控肝癌细胞的分子机制。方法:通过全转录组高通量测序分析肝癌患者血浆中Circ PNN差异表达。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肝癌细胞Huh-7、SK-HEP-1中Circ PNN表达。应用siRNA干扰技术沉默后,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖、流式细胞术检测凋亡、蛋白质印迹法(Western blot)检测半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达。Circ Bank数据库预测Circ PNN结合的miRNA及位点。结果:Circ PNN在肝癌患者血浆中的表达量显著高于非肝癌患者[差异倍数(FC)为268.63, P<0.05]。人HCC细胞系Huh-7和SK-HEP-1中Circ PNN的表达水平明显高于人正常肝细胞系HL-7702(8.206±0.118比0.950±0.010, P<0.05;20.822±0.288比0.950±0.010, P<0.05)。在SK-HEP-1细胞中转染Circ PNN siRNA-1和siRNA-2后,siRNA-1组、siRNA-2组细胞增殖能力低于对照组(0.826±0.040比1.022±0.053, P<0.05;0.492±0.027比1.022±0.053, P<0.05);siRNA-1组、siRNA-2组SK-HEP-1细胞凋亡能力明显高于对照组(16.633±0.404比4.800±0.608, P<0.05;27.133±0.751比4.800±0.608, P<0.05);siRNA-1组、siRNA-2组凋亡蛋白Caspase-3的相对表达量高于对照组(1.121±0.926比0.805±0.628, P<0.05;1.372±0.161比0.805±0.628, P<0.05),可促进细胞的凋亡能力。Circ Bank数据库生物信息学预测Circ PNN上结合的miRNA数量为10个。 结论:肝细胞癌通过增高Circ PNN表达,通过分子海绵机制作用于miRNA,下调Caspase-3表达从而促进肝癌细胞增殖、抑制凋亡,调控肝细胞癌发生、发展。
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编辑人员丨1天前
